3.6 Выращивание вирусов в культурах клеток

В настоящее время для выделения и размножения вирусов животных используются первичные культуры, штаммы клеток и установившиеся клеточные линии. В общих чертах процедура оказывается одинаковой для всех вирусов.

Среду удаляют с клеточного монослоя и монослой промывают сбалансированными буферными солевыми растворами (СБСР) или фосфатно-солевым буфером (ФСБ) для удаления ингибиторов (антител), которые могут присутствовать в среде. Вирусные частицы суспендируются в небольшом количестве СБСР или ФСБ и адсорбируются клетками в течение 30-60 мин. После этого солевые растворы заменяются свежей средой.

Заражение вирусами культивируемых клеток вызывает характерные морфологические изменения клеток. Конечные дегенеративные клеточные процессы (цитопатогенный эффект, ЦПЭ) обнаруживаются только через несколько недель роста в присутствии вирусов, но в ряде случаев ЦПЭ обнаруживаются уже через 12 ч. Детали морфологических изменений оказываются различными в случае разных вирусов.

Если вместо продуктивной инфекции вирус вызывает клеточную трансформацию, то это также сопровождается характерными изменениями морфологии и особенностей роста клеток.^[1]

4. Предосторожности при работе с зараженными вирусами клетками

Вирусы оказывают цитопатогенное действие и служат этиологическими агентами при многих заболеваниях человека и животных.

Для заражения клеток и роста зараженных вирусами клеток должна использоваться специальная комната или группа комнат.

Никакие живые вирусы не должны выноситься из этих помещений, не будучи заключены в плотно закрывающиеся контейнеры.

При работе с вирусами должны быть использованы специальные защитные одежды (лабораторные халаты). После работы эта одежда должна помещаться в специальный бак для автоклавирования.

Все среды и стеклянная посуда, которые были в контакте с вирусами, должны быть обработаны хлоросом; только после этого их можно выносить из помещения, предназначенного для работы с вирусами.

Вся пластиковая посуда должна быть помещена в специальный бак для автоклавирования.

Оборудование для хранения и обработки вирусного материала должно размещаться внутри помещения для работы с вирусами.

Лаборатория должна быть оснащена двухцикловыми автоклавами, чтобы сотрудники лаборатории были защищены от вредоносных материалов.

4.1 Обнаружение вирусов

Обнаружить присутствие вирусов и определить их количество можно с помощью целого ряда различных тестов, например:

1) Активность вируса измеряется путем определения количества содержащего вирус материала, необходимого для того, чтобы вызвать специфическую реакцию в организме хозяина. Наименьшее количество вируса, способное вызвать соответствующую реакцию, называется инфекционной единицей, и титр исходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных единиц, приходящихся на единицу объема.

2) Образование зараженными клетками нуклеиновых кислот, которые могут обладать характерной плотностью при центрифугировании в градиенте плотности или характерным размером при электрофорезе в агарозном геле или центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы.

3) Образование зараженными клетками или трансформированными клетками характерных антигенов, которые могут быть визуализованы с помощью окрашивания флуоресцирующими специфическими антителами либо вызывать изменения в клеточной мембране, приводящие к адсорбции гема.

Положительная реакция (желто-зеленый цвет в люминесцентном микроскопе) указывает на присутствие в клетках вирусных антигенов.

4) Наличие антигенов на вирусных частицах может приводить к реакциям гемагглютинации, позволяющим проводить количественную оценку. У многих вирусов имеются антигены, которые могут адсорбироваться на эритроцитах и вызывать их слипание. При взаимодействии большого количества вирусных частиц и эритроцитов образуется сеть клеток, и суспензия агглютинирует, т.е. эритроциты выпадают в осадок.

5) Образование зараженными клетками характерных ферментов, или ферментов, легко отличаемых по свойствам от соответствующих ферментов клеток-хозяев.