5.3. Получение безвирусного посадочного материала

Вирусные болезни – причина потери от 10 до 50 % урожая сельскохозяйственных культур, размножающихся вегетативно

Наиболее эффективный для оздоровления от вирусов, вироидов и микроплазм способ – культивирование меристем стебля или органов стеблевого происхождения. В основе используемого на практике явления лежит специфика строения точки роста растений. Дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр до 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм.

Расположенные ниже дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.

Такая особенность строения апикальной меристемы исключает проникновение в нее вируса за счет быстрого транспортирования по проводящей системе, но допускает возможность медленного распространения через плазмодесмы, соединяющие меристематические клетки.

Предпочтительно использовать предельно малый размер экспланта (0,075–0,1 мм) и разработать оптимальные условия для получения жизнеспособных пробирочных растений.

Рекомендуется дополнять культуру меристем термо- и хемотерапией.

Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специальные термокамеры, где в течение первой недели повышают температуру до 37^оС путем ежедневного ее увеличения на 2°С.

Еще один способ, применяемый для освобождения растений от вирусов – хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуанозина (коммерческое название вирозол) в концентрации 20—50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. При использовании вирозола процент безвирусных растений, полученных методом культуры меристем, увеличивался до 80–100 % по сравнению с 0–41 % в контроле. Положительные результаты хемотерапии были получены при оздоровлении сливы, черешни, малины, некоторых цветочных и других растений.

5.4. Культура изолированных клеток и тканей в селекции и генной инженерии растений

Селекционная практика основывается на двух принципиальных подходах: создание генетического разнообразия и отбор желаемых генотипов. Клеточные технологии предлагают принципиально новые пути для увеличения генетического разнообразия и скрининга форм с искомыми признаками.

Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей растений in vitro можно разделить на две группы по их использованию с целью создания растений с новыми полезными признаками (табл. 1). Первая группа методов – это технологии для облегчения и ускорения селекционного процесса.

Они не подменяют обычную селекцию, а служат ей. Вторая группа – технологии, предназначенные для создания генетического разнообразия исходных форм для селекции. Использование данных методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений.

Таблица 1. Виды методов культивирования изолированных клеток и тканей in vitro

Для облегчения и ускорения селекционного Процесса	Для создания генетического разнообразия и скрининга генотипов с важными признаками
Оплодотворение in vitro Культура незрелых зиготических зародышей Регенерация растений из тканей летальных гибридов Экспериментальная гаплоидия Клональное микроразмножение новых сортов, гибридов, линий (включая создание искусственных семян)	Использование сомаклональных вариантов Получение индуцированных мутантов на клеточном уровне Клеточная селекция Гибридизация соматических клеток Перенос чужеродных цитоплазматических генов Адресованный перенос ядерных генов

Особое место, как в селекции, так и в генетике занимает отдаленная гибридизация.

Однако при использовании данного метода экспериментатор сталкивается с проблемой нескрещиваемости из-за прогамной и постгамной несовместимости.

Прогамная несовместимость – физиологическая несовместимость партнеров при отдаленном скрещивании, проявляющаяся на этапе до оплодотворения.

Основной способ преодоления прогамной несовместимости – оплодотворение in vitro. Метод заключается в совместном культивировании пыльцы и неоплодотворенных семяпочек, которое может осуществляться двумя различными способами. В первом случае столбик пестика срезается, завязь помещается на питательную среду, и на нее наносят готовую пыльцу. Второй вариант данного метода предполагает вскрывание завязи и перенос на питательную среду кусочков плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на их поверности культивируется готовая пыльца.

Постгамная несовместимость – несовместимость таксономически отдаленных партнеров, которая наблюдается после оплодотворения, и приводит к образованию щуплых невсхожих семян.

Для их преодоления используется шунтирование нормального развития, его замена получением гибридной каллусной ткани из живых тканей проростка или зародыша и регенерация растений из каллусных клеток.

Выращивание зародышей на искусственной питательной среде называется эмбриокультурой.

Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ. Для культивирования недифференцированных зародышей требуются более сложные питательные среды, содержащие не только витамины и стимуляторы роста, но и дополнительные трофические факторы (набор аминокислот, необходимые сахара, осмотики типа сорбита и маннита, растительные экстракты неопределенного состава).

Таким образом, практические аспекты использования метода эмбриокультуры заключаются в следующем:

• возможности получения межвидовых и межродовых гибридов;

• сохранении важного для селекции материала путем культивирования in vitro изолированных семяпочек и потерявших всхожесть семян;

• сокращении длительного селекционного процесса путем ускорения in vitro прохождения жизненного цикла растения;

• получении из гибридной каллусной ткани сомаклональных вариантов.

Экспериментальная гаплоидия. Роль гаплоидных растений в генетических исследованиях очень велика. Применение их позволяет легче обнаружить рецессивные мутации, редкие рекомбинации, экспрессию введенного извне генетического материала.

Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь, они образуют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом. Кроме селекции гаплоидны также применяются в генно-инженерных исследованиях.

Клеточная селекция in vitro. Одна из наиболее сильных сторон культуры клеток растений в создании технологий для сельского хозяйства – это возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками, т.е. осуществлять клеточню селекцию in vitro.

Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объектов исследования используются каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты.

Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:

1. Прямая (позитивная) селекция – наиболее простой способ отбора мутантов, поскольку резистентные клетки могут быть отобраны в большом количестве по их способности расти в присутствии ингибитора, в то время как чувствительные клетки гибнут.

2. Непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели неустойчивых делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений.

3. Тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны.

4. Визуальная селекция и неселективный отбор – способы, при которых вариантная линия может быть идентифицирована визуально или с помощью биохимических методов.

Соматическая гибридизация - это метод получения гибридных растений в результате слияния протопластов, изолированных из соматических клеток родительских форм.

Соматическая гибридизация включает 4 этапа:

• выделение протопластов;

• их слияние;

• отбор и регенерацию гибридов;

• анализ растений–регенерантов.

Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими способами:

1. Физиологическая комплементация. Применяется в том случае, когда гибридные протопласты и исходные родительские формы различаются по составу оптимальной для их роста питательной среды.

2. Генетическая комплементация представляет собой такое взаимодействие генов в гибридной клетке, вследствие которого восстанавливаются функции дефектных генов. Для проведения отбора с помощью данного метода часто используют хлорофиллдефектность. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светозависимую хлорофильную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. Для осуществления отбора гибридов после слияния протопластов клеточные колонии пересаживали на среду, индуцирующую органогенез, и культивировали на свету.

3. Отбор по морфологическим признакам. Проводится в том случае, когда продукты слияния хорошо отличаются визуально. В качестве маркеров при идентификации гетероплазматического продукта достаточно часто используют пластиды.

1. Генетическая комплементация представляет собой такое взаимодействие генов в гибридной клетке, вследствие которого восстанавливаются функции дефектных генов. Для проведения отбора с помощью данного метода часто используют хлорофиллдефектность. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светозависимую хлорофильную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. Для осуществления отбора гибридов после слияния протопластов клеточные колонии пересаживали на среду, индуцирующую органогенез, и культивировали на свету.

2. Отбор по морфологическим признакам. Проводится в том случае, когда продукты слияния хорошо отличаются визуально. В качестве маркеров при идентификации гетероплазматического продукта достаточно часто используют пластиды.

Помимо соматической гибридизации существует еще один близкий по своей сути способ получения растений с новыми полезными признаками – это цибридизация. Цибридизация представляет собой способ введения важных цитоплазматических генов. При этом цибридные растения содержат цитоплазму обоих партнеров, ядро – одного. Разработаны следующие способы получения цибридов:

• слияние изолированного протопласта с цитопластом;

• слияние протопласта реципиента с протопластом, ядро которого инактивировано облучением и не способно к делению;

• микроинъекция;

• перенос с помощью липосом.

Благодаря цибридизации был осуществлен перенос генов, несущих признаки устойчивости к гербицидам, а также цитоплазматической мужской стерильности.

Генетическая трансформация растений. Центральным компонентом генно-инженерной технологии является набор приемов для переноса генов из одной биологической системы в другую.

К наиболее важным проблемам, для решения которых осуществляется генетическая трансформация растений, относятся повышение устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам, улучшение качеств запасных белков зерна, повышение эффективности азотфиксации и расширение круга культурных растений, способных к симбиотической фиксации азота, а также создание сверхпродуцентов биологически активных веществ.

В настоящее время разработаны следующие методы введения генетического материала в клетки растений (табл. 2).

Таблица 2. Методы введения генетического материала в клетки растений

Метод	Комментарии
Использование Ti –плазмид	Высокоэффективная система, но применима только для двудольных растений
Баллистический метод	Используется для широкого круга растений и тканей; достаточно простой метод
Использование векторов на основе вирусов	Неэффективный способ доставки ДНК в растительные клетки
Прямое введение генов в протопласты растений	Может использоваться для введения генов только в протопласты растительных клеток
Введение ДНК с помощью микроинъекций	Имеет ограниченное применение, поскольку единовременно инъекцию можно сделать только в одну клетку
Электропорация	Применяется для введения генов только в протопласты, из которых могут быть регенерированы целые растения
Слияние липосом	Применяется для введения генов только в протопласты, из которых могут быть регенерированы целые растения