4.2 Культивирование пикорнавирусов на примере получения полиовируса типа 3 в культуре клеток HeLa

В качестве конкретной методики культивирования вирусов можно привести способ выращивания полиовируса в перевиваемых клетках.

Все процедуры проводятся в стерильных условиях.

Определенные сублинии клеток HeLa (например, HeLa S3) могут расти в средах с низкой концентрацией ионов кальция (например, CaS2MEM). Для эффективного заражения существенно, чтобы клетки хорошо росли в виде однородной суспензии. Клетки осаждают низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 900 g) и ресуспендируют в среде CaS2MEM до концентрации ~ 2^.10⁷ кл/мл (~1/20 исходного объема).

К клеточной суспензии добавляют вирус в концентрации 10—50 БОЕ на клетку; инкубируют ее на магнитной мешалке в течение 1 ч при 35 °С.

Суспензию разводят той же средой до концентрации 2^.10⁶ кл/мл и добавляют 100 мкКи [³Н]-уридина.

Клеточную суспензию инкубируют в течение 8 ч, после чего осаждают клетки низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 900 g) и промывают один раз фосфатным буферным раствором (PBS), не содержащим ионов магния и кальция.

Клетки ресуспендируют в PBS (5-10⁷кл/мл) и проводят три цикла замораживания — оттаивания.

Остатки клеток удаляют центрифугированием.

Супернатант сохраняют для дальнейшей очистки.^[6]

5. Биотехнология на основе культивируемых клеток и тканей растений

5.1. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения

Растения отличаются от бактерий и особенно животных поразительным многообразием синтетических процессов. Количество биологически активных соединений, синтезируемых растениями, огромно.

Особый интерес для человека представляют те биологически активные соединения, которые могут быть использованы в медицине, технике, пищевой и парфюмерной промышленности, сельском хозяйстве. Если для получения ценных БАВ традиционно использовались целые организмы (микроорганизмы, растения, животные), то современная биотехнология нацелена на клеточные технологии, основанные на культивировании свободных и иммобилизованных клеток. Как альтернативные источники БАВ растительного происхождения клеточные культуры обладают следующими преимуществами:

• получение экологически чистых продуктов независимо от климата, сезона, погоды;

• создание клеточных линий-сверхпродуцентов путем генетических манипуляций;

• сохранение пула генов редких и исчезающих растений-продуцентов;

• возможность оптимизировать и стандартизировать условия выращивания; возможность автоматизации процессов.

Популяциям культивируемых in vitro растительных клеток присущи определенные особенности протекания процессов вторичного метаболизма. Важной их характеристикой является степень стабильности в отношении синтеза, транспорта и депонирования физиологически активных соединений. Высокая биосинтетическая способность может сохраняться в течение всего времени существования популяции.

В растительном организме синтез метаболитов, их транспорт и отложение в запас зачастую разделены во времени и осуществляются в разных органах растения.

В любом случае, на первом этапе культивирования стараются создать оптимальные условия для роста, то есть накопления биомассы, а затем исследуют влияние этих условий на биосинтез вторичных метаболитов.

Накопление вторичных метаболитов в культуре клеток растений зависит от ряда факторов. Во-первых, выход продукта определяется генотипом донорного растения, правильным выбором его ткани или органа для введения в культуру. В большинстве случаев это главное условие, определяющее качество получаемого продукта. Как правило, высокий выход продукта наблюдается в культурах, инициированных из высокопродуктивных растений.

Во-вторых, на выход продукта влияет гетерогенность культивируемых клеток по способности к синтезу вторичных метаболитов. Как отмечалось ранее, у культивируемых in vitro клеток могут происходить значительные изменения вторичного метаболизма по сравнению с интактными растениями. Одной из причин изменения интенсивности вторичного метаболизма в культуре клеток выступает генетическая их гетерогенность.

В-третьих, в качестве факторов, оказывающих влияние на накопление вторичных метаболитов в культуре клеток растений, выступают состав питательной среды и физические условия культивирования. Важнейшими компонентами питательных сред, эффективно регулирующими и первичный, и вторичный обмен клеток, являются фитогормоны.

Увеличение выхода вторичных метаболитов во многих случаях наблюдается при повышении концентрации сахарозы в питательной среде. Вместе с тем высокое ее содержание приводит к возрастанию осмотического потенциала, что может оказывать неблагоприятное влияние на метаболизм культивируемых клеток.

Среди других компонентов питательной среды регулирующее воздействие на накопление вторичных метаболитов могут оказывать источники азота, фосфора и калия.

Положительный эффект на биосинтез вторичных веществ оказывает наличие в среде некоторых предшественников самих искомых соединений. Это могут быть аминокислоты (глутамат, фенилаланин, лейцин, орнитин и др.) и органические кислоты (ацетат, сукцинат, шикимовая и др.).

Физическими факторами, влияющими на накопление БАВ клетками, являются освещенность, температура, аэрация и режим перемешивания в случае суспензии, а также состав газов в колбах.

В целом следует отметить, что накопление клетками продуктов вторичного метаболизма является результатом динамического равновесия между биосинтетическим, биотрансформационным и биодеградационным процессами.

Биотехнологическое производство вторичных метаболитов растений осуществляется преимущественно при культивировании клеточных суспензий. Очень большое значение для их роста и образования целевых продуктов имеют технические характеристики систем культивирования.

Растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования.

В зависимости от принципа перемешивания культуральной жидкости биореакторы подразделяются на два больших типа по своей конструкции. В биореакторах первого типа перемешивание осуществляется только путем аэрирования воздухом. При этом в барботажных биореакторах – за счет поднимающихся пузырьков воздуха, а в аэролифтных – с применением специальной конструкции с внутренним цилиндром, создающей градиент плотности суспензии (рис. 5.2). Для биореакторов второго типа характерно наличие механических перемешивающих устройств

Использование биореакторов для исследования популяций растительных клеточных имеет следующие преимущества:

• большой объем культивационного сосуда позволяет, не внося существенных возмущений, отбирать пробы большого объема, что очень важно при анализе вторичных метаболитов, часто содержащихся в очень низких концентрациях;

• возможность управления процессом культивирования по определенному алгоритму на основе показаний датчиков, установленных в биореакторах.

Вместе с тем культивирование клеточных суспензий в биореакторах связано и с некоторыми проблемами:

• оседанием клеток вследствие недостаточного перемешивания, что приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток;

• увеличением вязкости суспензии вследствие роста биомассы, приводящим к адгезии – прилипанию клеток друг к другу, поверхности культурального сосуда, погруженных в него мешалок и датчиков;

• образованием в верхней части сосуда «корки» или «безе», состоящей из полисахаридов, белков, слипшихся клеток и снижающей эффективность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели.

В настоящее время наиболее приемлемым способом получения больших количеств вторичных метаболитов растений является двустадийное культивирование. Его первая стадия связана с образованием больших количеств биомассы культивируемой суспензии, а вторая предполагает создание условий для активного биосинтеза необходимых продуктов.

Большой интерес предствляет также развитие методов иммобилизации культивируемых клеток и биотрансформации ими метаболитов. Суть иммобилизации состоит в заключении живых клеток в определенный носитель.

Затем через носитель с клетками пропускают питательную среду. При этом клетки прекращают рост, но могут достаточно долго оставаться живыми и продуцировать необходимые вещества. Клетки могут быть иммобилизованны 4 способами:

• иммобилизация в инертном субстрате, т.е. обволакивание клеток одной из различных цементирующих сред (альгинат, агар, полиакриламид, коллаген или комбинация гелей);

• адсорбция клеток на инертный субстрат;

• адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью биологических макромолекул;

• ковалентное связывание клеток с каким-либо инертным субстратом типа карбоксилметилцеллюлозы.

Иммобилизованные клетки могут быть использованы не только для синтеза, но и для биотрансформации различных соединений.

Таким образом, использование суспензионных культур для синтеза вторичных метаболитов в промышленных масштабах имеет большие перспективы. Работа по созданию клеточных технологий для получения вторичных метаболитов в настоящее время включает следующие этапы:

1. Экономически обоснованный выбор объекта. Растения, выбранные для введения в культуру, должны содержать значительные количества экономически важных вторичных соединений. Особенно это относится к исчезающим видам растений.

2. Первичное введение тканей в культуру. Для этих целей отбираются отдельные растения, обладающие наибольшим содержанием искомого вещества. Обычно вначале получают каллусы на твердой среде.

3. Биохимическое изучение биомассы по качественному и количественному составу вторичных метаболитов. В качестве экспресс-методов оценки продуктивности каллусных культур в последнее время применяют радиоиммунохимический и иммуноферментный методы.

4. Оптимизация сред и параметров выращивания. Для реализации генетической информации, детерминирующей вторичный обмен, требуются специфические условия.

5. Создание продуктивных штаммов клеток. Наиболее эффективным приемом создания продуктивных штаммов является искусственное конструирование клеток методами клеточной и генной инженерии

6. Первичное использование лучших штаммов в суспензионной культуре.

7. Выращивание продуктивной и устойчивой культуры в условиях, приближающихся к производственным, в ферментерах с последующим увеличением их емкости.

8. Составление технического регламента на производство биомассы клеточной суспензии и его оценка.