5.2. Клональное микроразмножение растений

Клональное микроразмножение – это использование техники in vitro для быстрого получения неполовым путем растений, идентичных исходному.

Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:

• высокий коэффициент размножения (105–106 – для травянистых, цветочных растений, 104–105 – для кустарниковых древесных, 104 – для хвойных);

• возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

• получение генетически однородного посадочного материала;

• освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;

• ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;

• сокращение продолжительности селекционного процесса;

• получение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

• возможность автоматизации процесса выращивания.

Области применения клонального микроразмножения разнообразны и

• имеют тенденцию к расширению:

• в селекции для поддержания и размножения растений с уникальными генотипами;

• для быстрого размножения новых и уже существующих сортов;

• массового получения оздоровленного посадочного материала у растений, подверженных вирусным заболеваниям;

• для быстрого размножения некоторых гетерозиготных садовых культур, обычно размножающихся семенами и расщепляющихся при скрещивании;

• для быстрого клонального размножения in vitro лучших экземпляров взрослых древесных растений, разведение и селекция которых

• осуществляется медленно вследствие длительности процесса полового размножения;

• для сохранения редких и исчезающих видов.

Основное требование к объектам, которые используются для микроклонального размножения, это сохранение генетической стабильности на всех этапах онтогенеза.

Существует много методов клонального микроразмножения, и различными авторами предлагаются разные системы их классификации.

Наиболее распространенной является классификация, согласно которой микроклональное размножение может осуществляться за счет:

• активации развития уже существующих в растении меристем (апекса стебля, пазушных и спящих почек, интеркалярных зон стебля);

• индукции адвентивных почек непосредственно тканями экспланта;

• индукции соматического эмбриогенеза;

• дифференциации адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной тканях (рис.5.3.).

Основной метод, используемый при клональном микроразмножении растений, – это активация развития уже существующих в растении меристем. Он основан на снятии явления апикального доминирования, что может быть достигнуто следующими путями:

а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим

микрочеренкованием побега на безгормональной среде;

б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа

действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов.

В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала технических (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощных культур (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.)

Второй метод – это индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и, таким образом, регенерировать целые растения.

Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинт, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев

Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, – индукция соматического эмбриогенеза – основывается на дифференциации зародышеподобных структур из соматических клеток, которые по своему внешнему виду напоминают зиготические зародыши.

Четвертый метод клонального размножения – дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани – мало используется для получения посадочного материала in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании каллусной ткани на питательную среду наблюдаются явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоидности клеток, структурные перестройки хромосом и накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциала культивируемыми клетками.

Процесс клонального микроразмножения можно разделить на есколько этапов:

1–й этап – выбор растения донора, изолирование и стерилизация

экспланта, создание условий для его роста на питательной среде in vitrо;

2–й этап – собственно размножение, осушествляемое одним из

четырех перечисленных выше способов;

3–й этап – укоренение размноженных побегов;

4–й этап – высадка растений–регенерантов в почву.

При разработке методов клонального микроразмножения растений необходимо учитывать влияние генетических, физиологических, гормональных и физических факторов. Это связано с тем, что методика, разработанная дляопределенного клона одного вида не всегда может быть применена для размножения другихпредставителей этого вида и тем более растений другого вида.

Экспериментально доказано, что двудольные травянистые растения обладают большими морфогенетическими потенциями, т. е. имеют более выраженную способность к индукции заложения адвентивных почек, росту побегов, укоренению и, в конечном итоге, получению более высокого коэффициента размножения, чем ткани и органы однодольных травянистых и, тем более, древесных растений.

Физиологический возраст исходного экспланта имеет несомненное значение в проявлении способности к морфогенезу. Зрелые зародыши, 20–30-дневные проростки или различные их части (ювенильный материал) обладают более высоким морфогенетическим потенциалом по сравнению с тканями взрослых растений, и способны образовывать в большом количестве адвентивные почки, стимулировать развитие пазушных меристем, которые в дальнейшем формируют хорошо растущие побеги, способные к укоренению.

К физиологическим факторам следует отнести и время (сезонность) изоляции экспланта. Ткани и органы, изолированные в момент вегетации растений, способны с высокой частотой образовывать адвентивные почки, формировать побеги и укореняться, чем ткани, изолированные в период глубокого и вынужденного покоя.

Размер экспланта является еще одним условием, определяющим успех микроразмножения: чем меньше размер экспланта, тем меньшей регенерационной способностью он обладает, и наоборот.

Гормональный баланс питательной среды – немаловажный фактор, влияющий на успех клонального микроразмножения. При высоком соотношении цитокининов к ауксинам происходит развитие пазушных меристем или образование адвентивных почек, при низком – индуцируется корнеобразование, при промежуточных значениях наблюдается образование и пролиферация каллуса.