Часть 1. Выделение клеточных ядер методом дифференциального центрифугирования

Целью данного раздела работы является выделение клеточных ядер для дальнейшей экстракции из них ФПФазы.

В основе метода дифференциального центрифугирования лежит разность в скоростях седиментации частиц, имеющих разные размеры и плотность.

Реактивы: CH₃COONa*3H₂O, CH₃COOH, KCl, MgCl₂*6H₂O, CaCl₂, NaCl, HCl, сахароза, трис.

Оборудование: центрифуга, гомогенизатор, ножницы, капроновый фильтр, марля, весы, микроскоп, центрифужные стаканы.

Ход работы

Перед работой готовят следующие растворы.

1. Буфер А:0,3 МNa-ацетатный буфер рН 5,8. Этот буфер готовят из 2М Na-ацетатного буфера рН 5,8,  который получают следующим образом:

CH3COONa*3H2O –255,8 г, CH3COOH (ледяная) – 7,2мл.

Объем доводят до1 л водой.

2. Буфер В: 10 мМтрис-HCl, рН 7,55, содержащий 0,25 Мсахарозы, 25 мМKCl, 10 мМMgCl₂:

трис –1,21 г, сахароза –85,5 г, KCl —1,86 г, MgCl2*6H2O –2,03 г, 0,1 н HCl – 80 мл.

Объем доводят до1 лводой.

 

3. Буфер С: 10 мМтрис-HCl, рН 7,55, содержащий 3 мМCaCl₂:

трис –1,21 г, сахароза –85,5 г, KCl –1,86 г, CaCl2 –0,333 г, 0,1 н HCl – 80 мл.

Объем доводят до1 лводой.

 

4. Раствор Д:0,2 М NaCl:

NaCl –11,7 г

Объем доводят до1 лводой.

  Клеточные ядра выделяют при температуре +4 ^оС.

  Выделение ядер включает следующие этапы.

1. После размораживания (2 –80 г) ткань измельчают ножницами.

2.  К измельченной ткани добавляют буфер В в соотношении 1 к 4. Затем ткань гомогенизируют в блендоре при максимальных оборотах 1 – 2 мин.

3. Гомогенат фильтруют через 2 слоя марли, затем через капроновый фильтр. Фильтрация необходима для отделения неразрушенных частиц и фрагментов фиброзной ткани.

4. Фильтрат центрифугируют при800 gв течение 7 минут. Центрифугат отбрасывают.

5. Осадок промывают буфером В. Для этого осадок ядер суспензируют в буфере и затем центрифугируют при800 gв течение 7 минут.

6.  Осадок промывают буфером С, так же как в предыдущем случае. Этот этап необходим для лизиса эритроцитов.

7. Осадок промывают раствором Д и затем буфером А. Очищенные ядра используют в дальнейшей работе.

 

Часть2. Экстракция фпФазы из клеточных ядер

  Для экстракции ферментов используют разные методы. К таким методам относятся: механическое разрушение ткани, ультразвуковая обработка, замораживание – оттаивание, использование различных соединений, которые способствуют салюбилизации ферментов и др.

  Целью данного раздела работы является определение концентрации Na-ацетатного буфера, которая более всего подходит для экстракции ФПФазы.

Реактивы: 2М Na-ацетатный буфер рН 5,8.

Оборудование: центрифуга, гомогенизатор, центрифужные стаканы.

Ход работы

 Для экстракции ФПФазы мы будем использовать 0,4, 0,6, 0,8 и1 МNa-ацетатный буфер рН 5,8. Эти буферы готовят из 2М Na-ацетатного буфера рН 5,8.

  Для экстракции ФПФазы к осадку ядер добавляют 4- кратный объем буфера соответствующей концентрации. Осадок ядер тщательно суспензируют и оставляют нахолоду на 20 мин. Далее суспензию центрифугируют, надосадочную жидкость используют в качестве препарата фермента. В пробах определяют активность фермента (лабораторная работа №12) и содержание белка (лабораторная работа №7). На основание этих данных рассчитывают общую и удельную активность препаратов ФПФазы. Результаты заносят в таблицу.

Концентрация буфера А, М	Содержание белка, мг	Общее содержание белка, мг	Общая активность ФПФазы, ед.акт.	Удельная активность ФПФазы, ед.акт./мг
0,4
0,6
0,8
1,0

 

На основании полученных данных сделайте вывод, какую концентрацию буфера предпочтительнее использовать.

Определение активности ФПФазы

 

Для определения активности ФПФазы используют реакцию гидролиза паранитрофенилфосфата (пНФФ), которая происходит по следующей схеме:

 

Паранитрофенол (пНФ) в отличие от пНФФ в щелочной среде имеет желтый цвет с максимумом поглощения при длине волны 410 нм. На этом свойстве основан принцип количественного определения продукта реакции.

Для определения активности ФПФазы используют следующие растворы.

Реактивы: 0,3 М Na-ацетатный буфер рН 5,8,3 мМ пНФФ в0,3 М Na-ацетатном буфере рН 5,8 (2,5 мг пНФФ растворяют в 1 мл буфера), 0,1 н NaOH, препарат фермента.

Оборудование: термостат, спектрофотометр, автоматические пипетки, пробирки, штатив.

Ход работы

Все растворы перед определением активности нужно прогреть при 37 °С в течение 5 – 10 минут. Затем приготавливают пробы по следующей схеме:

 

Проба	Буфер А, мкл	Субстрат, мкл	Препарат фермента, мкл
Опыт	0	50	50
Контроль	50	50	0

 

Ферментативную реакцию проводят при 37 °С в течение 15 минут. После инкубации реакцию останавливают добавлением 3 мл0,1 МNaOH. Опытная проба должна окрашиваться в желтый цвет. Контрольная проба – бесцветная. Желтый цвет в опытной пробе обусловлен присутствием в ней пНФ. После остановки реакции измеряют оптическую плотность раствора при 410 нм.

Количество полученного продукта определяют по интенсивности окраски пНФ в щелочной среде, используя молярный коэффициент экстинкции, равный 17,9 · 10³ М^-1 см^–1  по формуле:

Е₄₁₀ ·   V

Х = –––––––––––––,

17,9 · 10³

где:       

Х – количество пНФ в пробе (моль);

Е₄₁₀ – оптическая плотность опытной пробы;

V – объем пробы после остановки реакции (л);

17,9 ·10³ М^-1_.см^–1   – молярный коэффициент экстинкции.

Определив количество гидролизированного субстрата, расчитывают скорость ферментативной реакции, которую выражают в нмолях гидролизованного субстрата за 1 мин. Затем в пробе определяют количество фермента в единицах активности. За единицу активности принимают количество фермента, которое гидролизует 1 нмоль субстрата за 1 минуту.

5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА В БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

5.1 Хроматографические методы анализа

5.2 Спектральные методы анализа

5.3 Электрохимические методы анализа

Лекция 5. Методы исследования органических соединений

1. Масс спектрометрия;

2. Электронная спектроскопия;

3. Инфракрасная спектроскопия;

4. Спектроскопия ЯМР.

Химия – это область научных знаний и практической деятельности, которая развивается за счет синтеза новых соединений и создания материалов на их основе. Главной задачей химика-исследователя после синтеза соединения или комбинации известных соединений (материалов) является установление строения молекул или молекулярных ассоциатов.

МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Химические	Физические
Элементный анализ; Геометрия молекулы; Химический анализ; Встречный синтез.	Осколочная масс-спектрометрия; Молекулярная спектроскопия: - электронная; - инфракрасная; - ядерного магнитного резонанса; и др.

Масс-спектрометрия

Применяется для идентификации и определения молекулярной массы и молекулярной формулы вещества.

Молекулы, находящиеся в парообразном состоянии в глубоком вакууме, подвергаются бомбардировке электронами. Молекулы в этих условиях теряют один электрон. Образующийся молекулярный ион последовательно распадается на осколки-катионы, свободные радикалы или молекулы.

Молекулярная спектроскопия

Методы основаны на взаимодействии электромагнитного излучения с молекулами вещества.

Свет – распространение электромагнитных волн в пространстве.

Как любое электромагнитное колебание характеризуется скоростью, длиной волны и частотой.

Методы молекулярной спектроскопии основаны на взаимодействии вещества или смеси веществ, их растворов с различного вида излучениями. К ним относятся электронная,инфракрасная спектроскопия;метод люминесценции,оптическийирентгеновский спектральный анализ;рефрактометрия;поляриметрия;метод ядерного магнитного резонанса. На взаимодействии с магнитным полем основанметод электронного парамагнитного резонанса, последовательно с электрическим и магнитым –масс-спектрометрия.

В настоящее время спектрофотометрические методы с большим успехом используются при решении таких вопросов, как контроль чистоты химических соединений, идентификация, установление структуры, исследование различных видов изомерии, количественный анализ смесей, определение констант диссоциации кислот и оснований, исследование кинетики химических реакций, определение микропримесей и т.д.

Электронная спектроскопия

Изучает поглощение органическими веществами света в УФ области спектра (200-400 нм). Излучение с такой длиной волны поглощают только соединения, с  p-связями (С=О, С=С).

Поглощение света вызвано электронными переходами:

ИК-спектроскопия

Инфракрасные спектры возникают в результате возбуждения колебаний атомов и целых группировок в молекуле в результате поглощения тепловых квантов энергии, расположенных от 760 нм спектра.

Колебательные движения молекул

Структурный анализ по ИК-спектрам сводится в настоящее время к отысканию характеристических полос поглощения и их отнесению к соответствующим структурным элементам с учетом численных значений частот maxпоглощения, контура (формы) и интенсивности полос.

Характеристические частоты и их интенсивности для некоторых функциональных групп

Частота	Природа колебания	Тип соединения	Интенсивность
3640-3610	Валентные О-Н	Разбавленные растворы спиртов в неполярных растворителях	40-70
3530	Ассим. валентные свободной NH2	Разбавленные растворы первичных аминов	130
3415	Симм. валентные свободной NH2	То же	120
1820-1650	Валентные С=О	Карбонильные соединения	250-1250
1560-1480	Колебания кольца	Арены	50-100
1335-1310	Ассим. валентные –SO2	Алкилсульфоны	250-600
1160-1130	Симм. Валентные –SO2	Алкилсульфоны	500-900

ЯМР – спектроскопия

Метод пригоден для исследования молекул, в состав которых входят атомы с нечетным числом протонов или нейтронов. Такие ядра обладают ядерным спином и являются парамагнитными (ЯМР¹Н,¹³С,¹⁹F,³¹Р).

При взаимодействии излучения на исследуемый образец, ядра переходят с более низкого энергетического уровня на более высокий, происходит поглощение энергии.

Атомы в молекуле находятся в различном химическом окружении. Этой небольшой разницы достаточно для изменения разности энергий между спиновыми состояниями и, следовательно, частоты поглощаемого излучения (эффект экранирования).

Количественной характеристикой степени экранирования ядер служит химический сдвиг – расстояние между сигналом ядра и сигналом эталонного вещества, выраженного в миллионных долях величины напряженности внешнего тока.

Электроноакцепторные группы и сопряженные связи уменьшают экранированность (сигнал отмечается в более слабом поле);

В ароматических циклах, при действии на них сильного магнитного поля возникает кольцевой ток, собственное магнитное поле, что понижает напряженность внешнего поля (смещение сигнала в более слабое поле).

Параметры спектра:

• Положение сигнала (тип атома);

• Площадь сигнала (число атомов данного типа);

• Мультиплетность (форма) – число соседних атомов других типов.

Строение сигналов (мультиплетов) спектра ЯМР ¹Н

Название	Число пиков	Число Н у соседних атомов углеродов
Синглет Дуплет Триплет Мультиплет	1 2 3 х+1	0 1 2 х

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И ТЕРМИНЫ

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И ТЕРМИНЫ

Ароматичность – особый вид резонансного взаимодействия, при котором сопряжение реализуется в замкнутом цикле.

Биоорганическая химия– наука, изучающая строение, свойства и биологические функции органических веществ, участвующих в процессах жизнедеятельности.

Биополимеры– высокомолекулярные природные соединения, являющиеся структурной основой всех живых организмов и играющие определённую роль в процессах жизнедеятельности.

Биорегуляторы– соединения, которые химически регулируют обмен веществ.

Водородная связь– электростатическое взаимодействие атома водорода связанного с сильно электроотрицательным элементом, с с неподеленной парой электронов другого достаточно электроотрицательноготатома этой же или другой молекулы.

Гибридизация– смешение различных по форме орбиталей (s,p) при образовании связи.

Гомологи– это группа родственных органических соединений с однотипной структурой, каждый последующий член которой отличается от предыдущего на гомологическую разность (СН₂)_n.

Изомеры– вещества с одинаковым качественным и количественным составом, но различным строением и свойствами.

Индуктивный эффект– способность заместителя поляризовать σ-связь.

Ионная связь– ион-ионные взаимодействия, возникающие в результате полного перехода электронов от одних атомов к другим.

Ковалентная связь– химическая связь, образованная за счет обобществления электронной пары.

Конформеры– молекулы в определенной пространственной ориентации (конформации), в которую её атомы самопроизвольно возвращаются после небольших сдвигов при повороте по σ-связи.

Мезомерный эффект– влияние заместителя, обладающего р- или π- электронами, в результате которого происходит перераспределение π-электронной плотности связи.

Молекулярная спектроскопия– группа физических методов анализа основанных на взаимодействии вещества или смеси веществ, их растворов с различного вида излучениями.

Органические соединения– углеводороды и их производные.

π-связь– связь, образованная при боковом перекрывании негибридизованныхp_z-атомных орбиталей с максимумом перекрывания по обе стороны от прямой, соединяющих ядра атомов.

σ-связь– одинарная ковалентная связь, образованная при перекрывании атомных орбиталей по прямой (оси), соединяющей ядра двух связанных атомов с максимумом перекрывания на этой прямой.

Сопряжение– взаимодействие групп атомов, содержащих π- и (или)р-орбитали, приводящее к широкой делокализации электронной плотности в молекуле.

Стереоизомеры– пространственные изомеры, характеризующиеся различием положения заместителей в молекулах относительно друг друга в пространстве.

Таутомерия– явление динамического обратимого превращения изомеров, протекающее с разрывом и образованием связей и сопровождающееся перемещением атомов (чаще всего протона) и реже групп атомов.

Функциональная группа– атом или группа атомов, определяющие принадлежность к определенному классу и ответственные за его химические свойства.

Энантиомеры– оптические изомеры, вращающие плоскость поляризации в разные стороны, но на один и тот же угол.

1