15. Какие существуют методы культивирования вирусов? Как типируют вирусы?

Вирусы размножаются только в живых клетках. Культивирование вируса происходит на уровне орг-ма подопытного животного и на уровне культуры клеток (то есть вне орг-ма). Вирусы имеют тканевую и типовую специфичность. Поэтому при выделении неизвестного вируса одномоментно заражают 3-4 культуры клеток. Чаще используют эмбриональные ткани (куриный эмбрион). Вирусы оспы хорошо размножаются в хорион-аллантоисной оболочке, вирус паротита – в амнионе, вирус гриппа – в амнионе и аллантоисе, вирус бешенства – в желточном мешке. Берут 12-дневные эмбрионы.

При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами (на культуре клеток и куриных эмбрионах) инфекционный материал вводят лабораторным животным (мыши, кролики, обезьяны), после развития инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур.

Методы типирования вирусов:

1. микроскопические – вирусоскопия, обнаружение внутриклеточных включений;

2. иммуновирусологические – метод иммунной электронной микроскопии, метод иммунофлюоресценции, метод гемагглютинации, метод гемадсорбции.

Идентификация вирусов – иммуновирусологические методы, включают следующие реакции – торможение гемагглютинации, задержки гемадсорбции, связывания комплемента, нейтрализации, преципитации в геле агара.

16. Что такое первично-трипсинизированные и перевиваемые культуры клеток?

Применяются для выделения вирусов.

Первично-трипсинизированные культуры – сущность: разрушение межклеточных связей в тканях протеолитическими ферментами и разобщение клеток для выращивания монослоя на стекле. Источник получения: ткани и органы эмбрионов человека и животных, а также извлечённые у человека при операции. Используют нормальные и злокачественно перерождённые ткани. Способность клеток размножаться тесно связана со степенью дифференцировки ткани: чем ниже дифференцировка, тем лучше клетки размножаются in vitro. Поэтому ткани эмбриона и опухоли лучше использовать.

Культуры перевиваемых клеток – культуры клеток, способных к размножению неопределённо долгое время. Ткани берут чаще опухолевые.

17. По каким признакам можно судить о размножении вируса в культуре клеток?

Индикатором наличия вирусов в заражённой культуре клеток служат:

1. Развитие специфической дегенерации клеток – смотрят под микроскопом: образование многоядерных гигантских клеток, округление клеток, очаги клеточной пролиферации.

2. Обнаружение внутриклеточных включений – в цитоплазме или ядре (окрашивают и смотрят под микроскопом).

3. Обнаружение специфического Аг методом иммунофлюоресценции.

4. Положительная реакция гемадсорбции.

5. Положительная реакция гемагглютинации.

6. Образование бляшек – появляются обесцвеченные участки в культуре, состоящие из погибших клеток – это колонии вируса. Окрашивают красным красителем – бляшки круглые, светлые.

18. В чем заключается метод ифм диагностики инфекционных заболеваний?

В основе лежит иммунная реакция взаимодействия Аг с АТ. Они маркируются ферментами – пероксидазой или щелочной фосфатазой. После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, кот-й расщепляется ферментом. Среда окрашивается в жёлто-коричневый (при использовании пероксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы).

Этот метод позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие Аг с АТ. Метод высоко чувствителен (Аг достаточно 1 нг/мл).