1. Открытие клетки. Клеточная теория

Термин «клетка» был впервые предложен в 1665 г. английским исследователем Робертом Гуком, который при исследовании среза пробки заметил мелкие полости, похожие по форме на ячейки пчелиных сот, и назвал их ячейками, или клетками. В 1676 г. голландский натуралист Антони ван Левенгук впервые описал клетки животного организма, а также он открыл и описал эритроциты позвоночных, сперматозоиды, строение сердечной мышцы и одноклеточные организмы (простейшие).

В 1838–1839 гг. немецкие ученые – ботаник Матиас Шлейден и физиолог Теодор Шванн – сформулировали два основных положения клеточной теории:

1. Все организмы состоят из одинаковых структурных единиц – клеток.

2. Клетки растений и животных сходны по строению, образуются и растут по одним и тем же законам.

Немецкий ученый Рудольф Вирхов в 1858 г. обосновал принципы преемственности клеток путем деления: «Всякая клетка происходит из другой клетки…». Это утверждение стало третьим положением клеточной теории:

3. Новые клетки образуются только в результате деления исходных клеток.

Однако, технические возможности светового микроскопа были ограничены, и накопление материала о структуре клеток шло медленно. Изобретение немецкими учеными Эрнстом Руска и Максом Кноллем в 1931 г. электронного микроскопа и последующее усовершенствование с его помощью методов микроскопических исследований, позволило намного глубже изучить структуру и функции клеток. На основании полученных результатов были сформулированы основные положения современной клеточной теории.

٠Все живые организмы состоят из клеток.

٠Клетка – элементарная живая система, единица строения, жизнедеятельности, размножения и индивидуального развития живых организмов. Вне клетки нет жизни.

٠Клетки всех организмов сходны по строению и химическому составу, и в них сходным образом протекают процессы обмена веществ, хранения и реализации наследственной информации.

٠Новые клетки возникают только путем деления ранее существующих клеток.

٠Клеточное строение всех ныне живущих организмов – свидетельство единства их происхождения.

Таким образом, в начале ХХ века, благодаря созданию клеточной теории, сформировалось представление о единстве органической природы.

2. Методы изучения клетки

Самым распространенным методом изучения является микроскопирование. Световой микроскоп позволяет исследовать клеточные формы и структуры с увеличением изображения исходных объектов в 1000 раз. Электронный микроскоп дает возможность более детально исследовать структуру органоидов клетки, увеличивая исходное изображение в 100 000 – 500 000 раз. Методы прижизненного изучения клеток основаны на специфической обработке определенных компонентов клетки с последующей регистрацией выделенных структур (с помощью красителей, меченых радионуклеидами органоидов и т.д.).

2.1. Методы микроскопирования цитологических препаратов

Размеры изучаемых клеток и клеточных структур столь малы, что невидимы невооруженным глазом. Для детального изучения их структур применяют различные методы, наиболее распространенными из которых являются микроскопические методы исследования, подразделяющиеся на световую и электронную микроскопию (стандартные и специальные).

Метод стандартной световой микроскопии. Стандартная световая микроскопия осуществляется путем изучения препарата в проходящем свете: поступающий от источника световой поток в световом (светооптическом) микроскопе собирается конденсором и пропускается через исследуемый объект, изменяясь за счет различия свойств образующих его структур. Далее измененный световой поток поступает в объектив, в фокальной плоскости которого формируется изображение – его увеличенную проекцию можно наблюдать с помощью окуляра.

Главные характеристики микроскопа – разрешающая способность и увеличение. Разрешающая способность (разрешение) микроскопа – минимальное расстояние между двумя точками объекта, которые видны в нем раздельно, – обусловливается объективом и зависит от длины световой волны (повышается с ее уменьшением) и от особой оптической характеристики объектива – числовой апертуры (увеличивается по мере ее увеличения). Теоретическое разрешение светового микроскопа составляет 0,2 мкм, хотя практически оно, как правило, равно 0,4 мкм.

Увеличение микроскопа принято оценивать числом, которое представляет собой произведение из увеличений объектива и окуляра (обычно изображения исходных объектов увеличены в 150–900 раз).

Специальные методы световой микроскопии. К специальным методам относятся темнопольная, фазово-контрастная, поляризационная, интерференционная, ультрафиолетовая, флуоресцентная (люминесцентная) микроскопии.

Темнопольная микроскопия (микроскопия в темном поле) основана на использовании специального конденсора, обеспечивающего освещение препарата косыми лучами, не попадающими в объектив. В отсутствии объектов поле зрения представляется темным. При наличии объектов часть света отражается от них в объектив, в результате чего изображение объектов можно обнаружить через окуляр; мельчайшие частицы выглядят светящимися точками на темном фоне. Метод позволяет выявлять структуры, размеры которых лежат за пределами разрешения стандартного светового микроскопа. Метод темнопольной микроскопии широко используется для изучения живых клеток.

Фазово-контрастная микроскопия основана на неодинаковом изменении фазы световых лучей при их прохождении через различные структуры изучаемого объекта. Этот метод позволяет резко повысить контрастность изображения объекта и дает возможность непосредственного изучения живых клеток без их фиксации и окрашивания.

Поляризационная микроскопия используется для изучения структур, обладающих свойствами анизотропии или двойного лучепреломления. Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. В поле зрения поляризационного микроскопа в результате двойного лучепреломления (анизотропии) объекты оказываются ярко светящимися на темном фоне. В поляризационном микроскопе на объект направляется поляризованный пучок света, который в дальнейшем пропускается через анализатор (расположенный между объективом и окуляром) – устройство, определяющее отклонения плоскости поляризации света вследствие его прохождения через объект.

Интерференционная микроскопия — метод, при котором свет разделяется на два пучка. Один из них проходит через объект, другой – мимо него. Вследствие этого свет, прошедший через объект, испытывает фазовый сдвиг и изображение строится таким образом, что участки клетки с различной плотностью отличаются друг от друга разной степенью контрастности. Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная, но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Достигается это благодаря раздвоению луча света.

Ультрафиолетовая микроскопия — изучаемый объект освещается ультрафиолетовыми лучами, которые избирательно поглощаются его структурными компонентами. Так как ультрафиолетовые лучи имеют более короткую длину волны по сравнению с лучами видимой части спектра, разрешающая способность микроскопа повышается примерно вдвое. При ультрафиолетовом режиме микроскопирования невидимое изображение преобразуется в видимое с помощью люминесцентного экрана или других устройств. Данный метод применяется для повышения контрастности изображения (особенно внутриклеточных структур), что обусловило его широкое применение для цитохимических анализов.

Флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ излучать видимый свет при освещении объекта ультрафиолетовыми лучами (аутофлуоресценция). В некоторых случаях флуоресценция возникает после предварительной химической обработки биоткани. Применяют также флуоресцентные красители (флуорохромы), связывающиеся с различными структурами или веществами в клетках и межклеточном веществе. Люминесцентная микроскопия используется в диагностических целях для наблюдения живых или фиксированных микроорганизмов, окрашенных люминесцирующими красителями (флюорохромами) в очень больших разведениях, а также при выявлении различных антигенов и антител с помощью иммунофлюоресцентного метода.

Методы электронной микроскопии. В настоящее время в научных исследованиях и клинической диагностике широкое распространение получили два метода электронной микроскопии – трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия (ТЭМ) и сканирующая (растровая) электронная микроскопия (СЭМ), использующие соответствующие микроскопы. Первая из них (ТЭМ) основана на применении пучка электронов, излучаемого электронной пушкой внутри колонны микроскопа в условиях высокого ускоряющего напряжения (40–100 кВ) и глубокого вакуума (10^–4 мм рт. ст.). Фокусировка пучка осуществляется электромагнитными линзами, играющими роль конденсора, объектива и проектора. После прохождения через изучаемый объект, помещенный в колонну микроскопа и обладающий в различных своих участках неравномерной электронной плотностью, пучок электронов направляется на флюоресцирующий экран и создает плоскостное изображение объекта, которое фотографируется на пластинку или пленку.

Трансмиссионный электронный микроскоп имеет увеличение 100–500 тыс. раз и дает возможность изучения объектов, размеры которых лежат как в пределах разрешения светового микроскопа, так и далеко за ними (до уровня макромолекул).

Пучок электронов излучается электронной пушкой, состоящей из катода и анода, фокусируется электромагнитными линзами конденсора, объектива и проектора. После прохождения через изучаемый объект пучок электронов направляется на флюоресцирующий экран, создавая изображение объекта, которое регистрируется на фотопластинке или фотопленке.

Второй метод (СЭМ) основан на сканировании электронным пучком поверхности изучаемого объекта, что достигается благодаря его отклонению специальным устройством (дефлектором). Вторичные электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью объекта, воспринимаются детектором и фокусируются на экране СЭМ, создавая ее трехмерное изображение. Увеличение составляет 20 тыс. раз.

Пучок электронов, излучаемых электронной пушкой, фокусируется электромагнитными линзами конденсора и объектива. Этим пучком сканируется поверхность изучаемого объекта благодаря его отклонению дефлектором, который получает сигнал от генератора сканирования. Вторичные электроны, излучаемые поверхностью исследуемого объекта, воспринимаются детектором и фокусируются на экране, создавая трехмерное изображение.

Специальные методы электронной микроскопии. Электронно-микроскопическая цитохимия, иммуноцитохимия и авторадиография представляют собой методы, разработанные для использования на электронно-микроскопическом уровне. Они позволяют выявлять различные вещества и изучать процессы метаболизма на уровне отдельных клеток и их компонентов.

Электронно-микроскопический микроанализ (рентгеновский микроанализ) – метод, обеспечивающий выявление и количественную оценку содержания различных химических элементов в ультратонких срезах, а также в образцах, подготовленных для СЭМ. Данный метод основан на бомбардировке объекта узким пучком электронов, вызывающей излучение объектом вторичных электронов и рентгеновских лучей. Последние улавливаются специальным детектором, который регистрирует спектр, характерный для каждого химического элемента.

Методы замораживания–скалывания и замораживания–скалывания–травления дают возможность изучения внутренней структуры мембран и поверхности мембранных структур клетки.

Метод замораживания–скалывания основан на быстром замораживании клеток в присутствии криопротектора при температуре жидкого азота –196 °С и раскалывании в вакууме с помощью ножа. На поверхности скола, который часто проходит через гидрофобную середину билипидного слоя мембран, напыляют платину, органический материал удаляют, а полученный препарат (реплику) изучают под электронным микроскопом.

Метод замораживания–скалывания–травления используют при изучении наружной поверхности клеточных мембранных структур. В соответствии с этим методом, после быстрого замораживания и скалывания исследуемого участка проводится его травление – сушка в вакууме для удаления воды. На протравленную поверхность напыляют платину и полученную реплику изучают под электронным микроскопом.