Антиген

Гемолітична система

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

Фізіологічний розчин

Схема механізму РЗК для виявлення специфічних антитіл в сироватці крові обстежуваного

Додаток К

Постановка реакції термопреципітації за Асколі для виявлення антигену сибірки

Матеріал для дослідження (I) подрібнюють, заливають десятикратним об'ємом фізіологічного розчину і кип'ятять протягом 15 хвилин (II). Одержаний термоекстракт фільтрують до повної прозорості рідини (III). Одержаний фільтрат (IV) пастерівською піпеткою обережно нашаровують (V) на внесену попередньо в пробірку маленького діаметру сибіркову преципітуючу сироватку (VI). Якщо в досліджуваному матеріалі є антиген сибірки, то на межі контакту термоекстракту й сибіркової преципітуючої сироватки через 2 хвилини при кімнатній температурі утворюється тонке каламутно-біле кільце преципітації (VII).

Для уникнення спевдопозитивного результату реакції ставлять контролі:

1. преципітуюча сибіркова сироватка + стандартний специфічний преципітіноген

2. преципітуюча сибіркова сироватка + фізіологічний розчин

3. нормальна кінська сироватка + досліджуваний термоекстракт.

Перший контроль повинен бути позитивним, решта контролів – негативна.

Схема постановки реакції термопреципітації за Асколі для виявлення сибіркового антигену

Кип’ятіння

Облік

Сибіркова преципі-

туюча сироватка

1

2

3

Контролі

Механізм реакції термопреципітації за Асколі

+

=

Додаток Л

Схема постановки реакції наростання титру бактеріофага з досліджуваним матеріалом і на щільному живильному середовищі за методом агарових шарів Граціа

10^-6

10^-7

МПБ

По 0,5 мл

По 4,5 мл в кожну пробірку

10^-1

10^-2

10^-3

10^-4

10^-5

10^-10

10^-9

10^-8

При 37º С на 5-7 г.

По 2,5 мл 0,7% МПА 44-46°С

Чашки з 1,5% МПА

Другий шар в кожну чашку

Підрахунок кількості стерильних плям і визначення титру

Додаток М

Схема визначення чутливості бактеріальних культур до антибіотиків методом дифузії в агар із застосуванням стандартних дисків

Розміщення дисків з антибіотиками на поверхні мпа

Бактериальна культура, що досліджується

Висів бактеріальної культури ( газоном) на чашку з мпа

При 37ºС на 48 г.

Облік за діаметром затримки зони росту бактерій

Схема визначення чутливості бактерійних культур до антибіотиків методом серійних розведень

Постановка полімеарзної ланцюгової реакції (ПЛР) для виявлення ДНК збудника у дослідному матеріалі

Принцип ПЛР був описаний в 1986 р. До. Мullis, що одержав за це Нобелівську премію в 1993 р. В основі цього методу лежить багаторазове копіювання за допомогою ферменту ДНК-полімерази певного фрагменту ДНК, який є маркерним для даного виду.

Механізм копіювання такий, що комплементарне добудовування ниток може початися не в будь-якій точці послідовності ДНК, а тільки в певних стартових блоках — коротких двуниткових ділянках. Для створення стартових блоків в заданих ділянках ДНК використовують затравки (приманки) – спеціально синтезовані in vitro олігонуклеотиди завдовжки близько 20 нуклеотидів, так звані праймери. Праймери комплементарні послідовностям ДНК як на лівій так і на правій межах специфічного фрагмента і орієнтовані таким чином, що синтез ДНК, здійснюваний ДНК-полімеразою, протікає лише між ними. В результаті відбувається експоненціальне збільшення кількості копій специфічного фрагмента за формулою 2n, де n – число циклів ампліфікації. Оскільки праймери входять до складу фрагменту, що ампліфікується, його розмір визначається числом олігонуклеотидних пар між 5'-кінцями праймерів. Звичайно розмір фрагменту складає декілька сотень нуклеотидних пар.

Побудова нових ДНК ниток з дезоксирибонуклеотидтрифосфатів здійснює фермент термостабільна ДНК-полімераза, так звана Таq-полімераза. Процес ампліфікації полягає в повторенні циклів ампліфікації, що складаються з денатурації ДНК (1 хв.), „підпалу” праймерів (1—2 хв.) і побудови фрагмента (1—2 хв.).

Використовування термостабільної ДНК-полімерази дозволило автоматизувати процес ампліфікація за допомогою спеціального приладу, званого термоциклером. Цей прилад автоматично здійснює зміну температур згідно заданій програмі і числу циклів ампліфікації.

В результаті 30—35 циклів ампліфікації синтезується 108 копій фрагмента, що робить можливим візуальний облік результатів після електрофорезу в агаровому або акріламідному гелі.

Допоміжним засобом для реєстрації є трансілюмінатор – джерело ультрафіолетового випромінювання яке використовується для дослідження люмінесцентних „слідів” в рідинах та гелях. На сьогодні задачу швидкого (протягом декількох хвилин) отримання зображення гелю й повного кількісного аналізу ДНК/РНК-фрагментів дедалі частіше вирішують з допомогою системи гельдокументації. Остання включає високочутливу CCD-відеокамеру з Zoom-об'єктивом і спеціальним УФ-фільтром флуоресцентних ДНК/РНК-фарбників, які звичайно використовуються; цифрову відеокарту для PC (аналого-цифровий перетворювач) з високим дозволом; комп'ютерну програму для отримання і архівації зображення гелю; комп'ютерну програму для кількісного аналізу і визначення розміру/маси ДНК/РНК-фрагментів в агаровому гелі; повне комп'ютерне забезпечення; сучасний digital термопринтер; темну камеру з вбудованим в неї трансілюмінатором й кріпленням для камери.

Таким чином, виконання ПЛР включає:

1. Підготовку матеріалу до виділення ДНК

2.Виділення тотальної ДНК.

3.Отримання одноланцюгової ДНК (температурна денатурація).

4. Зниження температури.

5. Внесення у препарат з одноланцюговою ДНК термостабільної ДНК- полімерази

6. Внесення в препарат з одноланцюговою ДНК та термостабільною ДНК- полімеразою праймерів-затравок та нуклеотидів (будівельні матеріали для майбутньої ДНК).

7. Процес ампліфікації з допомогою термістера (Синтез нових молекул ДНК, підвищення температури, температурна денатурація, зниження температури, внесення праймерів та нуклеотидів, синтез нової ДНК, температурна денатурація (повторення 30-40 циклів).

8. Проведення електрофорезу чи реакції гібридизації НК.

9. Облік та аналіз результатів.