Занятие 5. Изучение ферментов дыхания растений Задание 19. Обнаружение дегидрогеназ в семенах гороха

Дегидрогеназы - это ферменты, активирующие и отщепляю­щие водород от окисляемого субстрата. Обнаружение дегидрогеназ основано на их способности передавать водород какому-нибудь акцептору, который, восстанавливаясь, меняет свою окраску. В качестве акцептора водорода может быть метиленовая синь, переходящая в восстановленном состоянии в бесцветную лейкоформу.

Ход работы. С семян набухшего гороха снять кожуру. Семена поместить в две пробирки. В одну из них налить воду и довести до кипения, чтобы убить ткани семян. После охлаждения воду слить и обе партии горошин (кипяченые и некипяченые) залить 1%-м раствором метиленовой сини для окрашивания. Через 5-10 мин синь из пробирок слить, семена промыть водопроводной водой. После промывания все семена должны иметь темно-синюю окраску.

Окрашенные семена залить отстоянной водопроводной водой, пробирки закрыть резиновыми пробками, то есть создать анаэробные условия, и поместить в термостат или водяную баню с оптимальной для работы дегидрогеназ температурой около 30° - 35°С.

Через 1,5-2 часа можно заметить, что непрокипяченые семена теряют синюю окраску. Это происходит потому, что дегидрогеназы, участвующие в дыхании клеток, активировали и сняли водород с дыхательного материала, а затем передали его на метиленовую синь, которая восстановилась и обесцветилась. Если с обесцвеченных семян слить воду, то на воздухе они снова синеют, так как лейкоформа метиленовой сини окисляется.

Семена в контрольной пробирке остаются синими, поскольку при кипячении дегидрогеназы разрушились. Аналогичные опыты можно провести с любым неокрашенным растительным материалом. После проведения опыта зарисовать живые и мертвые семена, описать и объяснить полученный результат.

Задание 20. Обнаружение пероксидазы в соке клубня картофеля

Пероксидаза относится к группе ферментов оксидаз. По хи­мической природе это гемопротеид, который, с помощью перекиси водорода, катализирует дегидрирование различных субстратов, например фенолов, которые при окислении превращаются в хиноны. Пероксидаза широко распространена в растительных тканях. В этом легко убедиться, выполнив предлагаемую ниже работу.

Ход работы. Клубни картофеля измельчить на пластмассовой терке и из полученной массы через марлю отжать сок, который богат ферментом пероксидазой. В три пробирки налить по 5 мл 1%-го раствора гидрохинона, приготовленного на прокипяченной дистиллированной воде перед началом опыта. В первую пробирку добавить по 1 мл 3%-го раствора перекиси водорода и картофельного сока, во вторую - внести только перекись водорода, а в третью - сок клубня картофеля.

Интенсивное побурение наблюдается только в первой пробирке, где происходит окисление гидрохинона в хинон за счет кислорода перекиси при участии фермента пероксидазы. Во второй пробирке окраска раствора почти не изменяется, но при длительном стоянии может появиться слабое побурение, так как гидрохинон окисляется кислородом, образующимся при спонтанном разложении перекиси водорода. Медленное побурение может наблюдаться и в третьей пробирке за счет окисления гидрохинона кислородом воздуха при участии фермента полифенолоксидаза, также в небольшом количестве содержащегося в соке клубня картофеля.

Результаты наблюдений записать в таблицу, на основании их сделать вывод о характере действия фермента пероксидазы.

Таблица16.

Схема записи опыта

Варианты	Состав смеси в пробирках			Окраска раствора в пробирках
	гидрохинон	Н2О2	сок клубня
1	+	+	+
2	+	+	_
3	+	_	+