7.10 Застосування методу рекомбінантних днк у біодеградації

Генетична селекція in vivo може забезпечити здатність організму до розкладу специфічної речовини. Але подібні методики потребують тривалого періоду селекції (8—10 міс., як описано вище) і грунтуються на випадковому наборі генетичного матеріалу для отримання бажаної катаболічної системи. Використання методів рекомбінантної ДНК дає експериментаторові можливість сполучати разом певні катаболічні послідовності і контролювати експресію специфічних генів. Рівень експресії, визначуваний in vivo, залежить від регуляторних механізмів, що кодуються плазмідними послідовностями, і мало що можна зробити, щоб вплинути на вихід окремих ферментів. Проте можна отримати підвищений рівень генного продукту, клонуючи певні гени у векторах по напряму транскрипції промоторних послідовностей.

Застосування методів клонування для маніпуляції генами не може розглядатися як панацея, що забезпечує при всіх обставинах отримання мікробіологічних систем для боротьби з будь-якими забрудненнями.

Є ряд обмежень при використанні методології клонування для отримання «суперштаму»:

• багатоступеневість біодеградації;

• нова природа деградативних організмів;

• обмежені знання про індивідуальні катаболічні шляхи;

• можливість попадання створених організмів в навколишнє середовище.

Перше обмеженя вказує, що складна структура ксенобіотиків вимагає багатоетапних шляхів для досягнення повної мінералізації. Клонування одного або двох генів в організмі дає йому можливість разкладати речовину тільки тоді, якщо нові генні продукти доповнюють існуючі катаболічні системи. Лише в цьому випадку клонування розширить метаболічні можливості організму. Застосування цих методів дозволить більш направленно конструювати організм.

Слід підкреслити, що навіть новітня методологія може використовуватися тільки для отримання організмів, здатних рости на одному або двох субстратах. Часто ця здатність залежить також від шкідливих мутаційних подій, що відбуваються внаслідок маніпуляцій in vitro, оскільки нашого розуміння генетичних механізмів ще недостатньо для направленого отримання бажаних генетичних форм. Це відображає недолік генетичних знань про ці організми, такі важливі для процесів біологічного очищення.

На сьогодні добре розроблені методи клонування для Escherichia coli і декількох видів Bacillus і Streptomyces, а клонування для псевдомонад в основному складається з маніпуляцій з катаболічними плазмідами або їх частинами.

Відсутність знань про метаболічні шляхи також обмежуються застосуванням методів рекомбінантної ДНК для прискорення прогресу в цій області. Без таких знань про метаболічні шляхи неможливо ідентифікувати гени, які найвигідніше клонувати, особливо ті, які лімітують набір субстратів або швидкість їх використання. Їх переваги наочно видно у разі двох описаних систем, де критичні етапи, лімітуючі набір субстратів метаболічного шляху, пов'язані з трьома ферментами метаболізму р-кетоадипату.

Передумовою використання методів рекомбинантної ДНК є існування векторних систем для передбачуваного продуцента.

Для ряду організмів, що використовуються для боротьби із забрудненнями, не існує добре охарактеризованих векторів. Один з можливих шляхів вирішення цієї проблеми — це використання векторів з широкого кола власників, наприклад вектора R300B. Коло власників цієї плазміди включає Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Methylophіlus methylotrophus і види Acinetobacter, Alcaligenes, Klebsiella, Proteus, Providencia, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Salmonella і Serratia. Використання таких векторів, знаходиться на ранній стадії, і одна з основних проблем цих систем — стабільність. Стабільність системи власник—вектор особливо важлива, якщо організм випускають в навколишнє середовище.

Можливість використання сконструйованих організмів для боротьби із забрудненнями навколишнього середовища ще не перевірена за межами лабораторії.

Пропозиції по маніпуляції природними ізолятами з подальшим поверненням їх в навколишнє середовище цікаві, але навряд чи здійсненні. Просте переміщення організму з навколишнього середовища і культивування його в лабораторії, особливо на збагаченому живильному середовищі, проявиться в селекції мутацій, які пристосовують організм до нових умов. Повернення організму в початкове середовище вже з забезпеченою новою катаболічною функцією, що дає йому можливість використовувати субстрат, недоступний решті членів мікробіологічної асоціації, і лише теоретично дає цьому організму селективну перевагу. Проте, природнє середовище буде містити і інші джерела вуглецю; скиди токсичних відходів зазвичай містять багато хімічних речовин, включаючи і легкозасвоювані. У таких умовах сконструйовані організми повинні володіти високою стабільністю, щоб забезпечити ефективніше використання цільової речовини.

Мало або нічого не відомо про стабильність генетично вдосконалених рекомбінантних штамів в природному середовищі. Крім того, початкова природна популяція, добре адаптована до довкілля, подібна по своїй конкуренто спроможності генетично вдосконаленого штаму.

Застосування методів рекомбінантної ДНК для отримання біологічних агентів для боротьби із забрудненнями знаходиться на ранній стадії, але є метод, який може виявитися корисним в майбутньому, — це генетичне зондування. Відбір організмів, здатних трансформувати нове з'єднання хімічних елементів, часто заснований на здатності використовувати речовину як субстрат росту. Якщо зростання слабке або субстрат тільки кометаболізується, то методи селекції виявляться непридатними для ідентифікації деградативной здатності.

Отже, було б корисно розвивати генетичне зондування для визначення специфічних послідовностей в плазмидах і хромосомах, це необхідно для визначення катаболічного потенціалу, навіть якщо цей потенціал не експрессируется. Такі зонди розроблені для TOL-плазмид. Наукова група Сейлера використовували метод ДНК — ДНК-гібридизація для визначення катаболічного генотипу в мікроорганізмах з навколишнього середовища. Метод може визначити одну бактерійну колонію, що містить TOL-плазмиду, серед 106 колоній Escherichia coli. Такий могутній інструмент матиме величезне значення для виділення прихованих катаболічних функцій .

Насьогодні існує велика різниця в місцях утилізації потенційних забруднень із стічних вод між:

досягненнями в направленому конструюванні організмів

і прикладною технологією використання сконструйованих організмів

Промислові відходи і стічні води рідко є простими розчинами, що містили б одну речовину забруднення. Враховуючи обмеженість способів, якими можна маніпулювати окремими організмами, вірогідно, що найбільш ефективними будуть біологічні системи детоксикації, що складаються з мікробіологічного консорціуму індивідуальних організмів або їх співтовариств, отриманих шляхом, маніпуляцій in vivo і in vitro.

Сучасні уявлення про фізіологічні, біохімічні і генетичні взаємини між компонентами співтовариства поклали в основу такого консорціуму якісний критерій, заснований на її здатності до ефективної детоксикації середовища. Для повного розкриття можливостей біотехнологічної боротьби із забрудненнями необхідно глибше вивчення кінетики окремих процесів.