Морфология и тинкториальные свойства

Дифтерийная палочка (палочка Клёбса-Лёффлера) представлена тонкими, слегка изогнутыми или прямыми палочками размером 1-12x0,3-0,8 мкм. Часто они утолщены на концах и напомина­ют булаву [от греч. согупе, булава]. Для дифтерийной палочки характерен выраженный поли­морфизм. Наряду с типичными формами, можно обнаружить карликовые, кокковидные, толстые с колбовидным утолщением на концах, гигантские, клиновидные, нитевидные, ветвящиеся и другие формы. На поверхности бактерий имеются фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки. У С. diphtheriae выделяют три биовара — gravis, mitis и intermedius. • Бактерии биовара gravis — короткие неправильной формы, с небольшим количеством мета-хроматических гранул.

• Биовар mitis образуют длинные изогнутые полиморфные палочки, содержащие много во-лютиновых зёрен (тельца Бабеша-Эрнста).

• Бактерии биовара intermedius наиболее крупные, с бочковидными очертаниями; для них харак­терны поперечные перегородки, разделяющие клетку на несколько сегментов. В настоящее время биовар intermedius относят в группу gmvis. С. diphtheriae хорошо окрашивается основ­ными анилиновыми красителями, грамположи-тельна (окрашивание не всегда равномерно). Для окраски мазков обычно применяют щелоч­ной метиленовый синий по Лёффлеру либо окрашивают их по Найссеру. Бактерии способ­ны образовывать L- и фильтрующиеся формы. В мазках С. diphtheriae располагаются в виде «растопыренных пальцев», «иероглифов», «пар­кета», латинских букв V, Y, L и т.д. (рис. 14-1).

Культуральные свойства. Дифтерийная палочка хорошо растёт при 36-37 °С; оптимум рН 7,4-8,0. Питательные среды должны содержать аминокислоты, витамины, ионы металлов (Са²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺ и др.), играющие роль ростовых факторов. На сывороточных средах (например, среде Лёффлера) дают рост уже через 10-12 ч; за это время контаминирующая микрофлора обычно не успевает развиться. Наибольшее распространение получили среды с теллуритом, так как возбудитель резистентен к высоким концентрациям теллурита калия или натрия, ингибиру-ющим рост сопутствующей микрофлоры. На таких средах возбудитель образует серовато-чёр­ные колонии в результате восстановления теллурита до металлического теллура, аккумулирую­щегося внутри бактерий (рис. 8, см. цветную вклейку). В жидких средах образуют помутнение и осадок; их образование и характер варьируют у различных биоваров.

Биохимическая активность. С. diphtheriae сбраживает с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, декстрин; не разлагает сахарозу, лактозу, маннит. Способность разлагать крах­мал и гликоген варьирует у различных штаммов, что используют для внутривидовой дифференци-ровки. Дифтерийная палочка не гидролизует мочевину и не образует индол. Отсутствие способно­сти ферментировать сахарозу и разлагать мочевину — дифференцирующий признак, оттчаю-щий дифтерийную палочку от других коринебактерий. Другой дифференцирующий признак — способность разлагать цистин. С. diphtheriae продуцирует каталазу, гиалуронидазу, нейраминида-зу, ДНКазу, уреазу и др. Цистиназная активность — дифференцирующий признак С. diphtheriae. Дифтерийная палочка лизирует эритроциты морской свинки и кролика. Биовары возбудителя дифте­рии существенно различаются по культуральным (табл. 14-1) и биохимическим свойствам. Среди дифференциально-диагностических биохимических тестов наиболее часто учитывают различия в способности разлагать углеводы и мочевину (рис. 14-2).

Бактериоцины. Дифтерийная палочка образует бактериоцины (корицйны), обладающие узким спектром действия. Гены, кодирующие синтез бактериоцинов, передаются плазмидами. Бактериоцины образуют как токсигенные, так и нетоксигенные штаммы. Токсинообразование

С. diphtheriae продуцирует мощный экзотоксин — основной фактор патогенности. Нетокси­генные штаммы не вызывают развитие заболевания. В чистом виде токсин впервые получили Э. Ру и А. Иерсён (1888), что явилось решающим моментом для установления этиологической роли микроорганизма. Токсин проявляет все свойства экзотоксина (термолабильный, высоко­токсичный, иммуногенный белок, нейтрализуемый антитоксической сывороткой). Нативный токсин — полипептид с М_г около 72 000; его образуют фрагменты А (проявляет ферментатив­ную активность) и В (взаимодействует с клеточными рецепторами, облегчая проникновение фрагмента А). Клетки всех чувствительных организмов способны рецептировать В-фрагмент и поглощать молекулу посредством эндоцитоза. В кислой среде эндосом (фаголизосом) дисуль-фидные связи, объединяющие оба компонента, разрушаются, фрагмент В взаимодействует с мембраной эндосомы, облегчая проникновение фрагмента А в цитоплазму. Последний устойчив к денатурации и длительно сохраняется в цитозоле. Механизм цитотоксического действия свя­зан с модификацией белков через АТФ-рибозилирование. Подобным свойством обладают мно­гие токсины, но лишь дифтерийный токсин и токсин A Pseudomonas aeruginosa имеют специ­фичную мишень — фактор элонгации 2 — трансферазу, ответственную за наращивание (элон­гацию) полипептидной цепи на рибосоме.

Дифтерийный токсин катализирует перенос АТФ-рибозы от цитоплазматического никотин-амиддинуклеотида (НАД) к фактору элонгации 2, приводя к АТФ-рибозилированию гистиди-новых остатков в молекуле фактора с необратимым блокированием элонгации полипептидной цепи (то есть любого белкового синтеза). Немодифицированный фактор элонгации 2 образует комплекс с ГТФ и тРНК, связывающийся с мРНК в эукариотических клетках, после чего возможно встраивание аминокислот в синтезируемую белковую молекулу. Токсин ингибиру-ет белковый синтез, в том числе и в миокарде, приводя к структурным и функциональным нарушениям, способным вызвать смерть больного. Результат действия токсина на нервную ткань — демиелинизация нервных волокон, часто приводящая к параличам и парезам. Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, инфицированные бактериофагом (р-фаг), несущим ген tax, кодирующий структу­ру токсина. Образование последнего наиболее выражено при вступлении бактериальной по­пуляции в стадию отмирания. Переход умеренного фага в литическую форму мало влияет на синтез токсина.

Активность токсина. 1 ЕД Dim дифтерийного токсина равна наименьшей концентрации, уби­вающей морскую свинку массой 250 г на 4-5-е сутки (около 0,25-0,1 мкл). Для получения анатоксина (ослабленного нагреванием при 40 °С дифтерийного токсина) используют штамм PW-8 либо его варианты — «Массачусетс», «Торонто» и др. Антигенная структура. У С. diphtheriae выделяют О- и К-Аг. Липидные и полисахаридные термолабильные фракции 0-Аг коринебактерий преимущественно представлены межвидовы­ми Аг. Поверхностные термолабильные К-Аг (нуклеопротеиды, белки) обеспечивают видовую специфичность и проявляют выраженную иммуногенность. С помощью анти-К-сывороток диф­терийные бактерии разделяют на серологические варианты (около 58). Биовар mitis включает 40 сероваров, gravis— 14, intermedius— 4. В отечественной практике используют диагности­ческие агглютинирующие, неадсорбированные сыворотки; в том числе полигрупповые и к серо-варам для РА на стекле и в пробирках.

Патогенез поражений. Входные ворота для возбудителя — слизистые оболочки носо­глотки, иногда глаз, половых органов (у женщин), повреждённые кожные покровы. Дифтерий­ная палочка колонизирует ткани в месте внедрения, вызывая развитие местного фибринозного воспаления. При этом тип воспаления зависит от строения слизистых оболочек. Например, в однослойном цилиндрическом эпителии дыхательных путей формируется крупозное воспале­ние, на многослойном плоском эпителии образуется жёлто-серая фибринозная плёнка, плотно спаянная с прилежащими тканями. Подобный тип поражений известен как дифтеритическое воспаление. Разрастание плёнок и переход процесса на воздухоносные пути могут вызвать асфиксию. Системные проявления обусловлены действием токсина, поражающего нервную си­стему (преимущественно периферические симпатические узлы), сердце и сосуды, надпочечники и почки. Ферменты С. diphtheriae (гиалуронидаза, нейраминидаза, фибринолизин) обеспечива­ют проникновение возбудителя в различные ткани, включая кровоток. Однако (в отличие от токсинемии) бактериемия клинически не проявляется.

Клинические проявления. Продолжительность инкубационного периода заболевания 2-12 сут. В клинической картине дифтерии выделяют сменяющие друг друга период манифестных проявлений фибринозного процесса и ранних токсических осложнений (первые 5-10 сут), пе­риод поздних токсических осложнений (не обязательный, с 10-12 сут до 6 нед), период рекон-валесценции (2-3 мес после исчезновения проявлений). В зависимости от локализации процес­са выделяют поражения ротоглотки (наиболее часто), дыхательных путей, носа и редкой лока­лизации (глаза, наружные половые органы, кожа, раневые поверхности). Принципы микробиологической диагностики

С целью раннего выявления заболевания и определения носителей необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов. Забор материала проводят двумя стериль­ными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч. Бактериоскопия. Окраска по Граму не является специфичной, так как бактерии сравнитель­но плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иерог­лифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабёша-Эрнста и отли­чить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hof-mannii), часто обитающей в носоглотке.

Культивирование. Бактерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (напри­мер, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке). Для выделения чистой культуры часть подозри­тельной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определе­ние цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным «пёстрым» рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, моче­вина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатогенных коринебактерии (рис. 14-3). Для идентификации биоваров используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и глико­ген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растёт только С. diphtheriae). Определение токсигенности

Определение in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бак­териальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизи­рованные животные погибают в течение 3-5 сут.

Определение in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатического эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, мечен­ных пероксидазой. Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tax в бак­териальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиф-фузии Илека. На среду с пониженным содержанием Fe²⁺ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетокси-генного штаммов параллельными штрихами. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином. Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации, так назы­ваемые «усы» или «стрелы» (рис. 14-4). На практике используют модификацию метода. По­лоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски. Контролем служит заведо­мо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с

линией преципитации токсигенного штамма (рис. 14-5). Фаготипирование. Для дифференциальной диагностики воз­будителей используют набор из 9 коринефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.

Лечение. Поскольку патогенез поражений обусловлен дей­ствием токсина, то основу специфической терапии составляет противодифтерийная лошадиная сыворотка (антитоксин), со­держащая не менее 2000 международных антитоксических еди­ниц активности (ME) в 1 мл. Антитоксин вводят внутримышеч­но или внутривенно в дозах, соответствующих тяжести заболе­вания (от 20000 до 100 000 ЕД). Открытие Э. Берингом и Ш. Китаза'то антитоксических свойств сыворотки иммунных животных явилось одним из важных этапов развития микробио­логии, а практическая медицина получила возможность проти­востоять этой высоколетальной инфекции. Параллельно назна­чают эффективные антимикробные препараты (аминогликозиды. цефалоспорины), а также проводят симптоматическую те­рапию. Выписку больных проводят только после двукратного отрицательного результата бактериологического обследования.