Тема 3. Оплодотворение.

Оплодотворение – слияние сперматозоида с яйцеклеткой, в результате которого их ядра объединяются в единое ядро оплодотворенного яйца. Сп-д выполняет две функции – 1. -побуждение яйца к развитию. Эта функция неспецифическая, которая может быть заменена рядом физических и химических агентов. Они вызывают партеногенез – развитие яйцеклетки без участия сп-да. 2ая функция – специфическая – внесение в яйцеклетку генетического материала отца.

Процесс оплодотворения очень сложный и многоплановый, но по времени очень быстрый.

Взаимодействия половых клеток – гамет- можно разделить на 3 фазы:

1. Дистантные - осуществляются на некотором расстоянии до соприкосновения гамет.

2. Контактные – при непосредственном соприкосновении поверхностей гамет.

3. Процессы, протекающие после вхождения сп-да в яйцеклетку.

Дистантные взаимодействия

Они направлены на повышение вероятности встречи сп-да с яйцеклеткой. Осуществляются благодаря выделению яйцеклеткой аттрактантов – веществ, для которых в мембране сп-да есть специфические рецепторы. Одни аттрактанты просто активируют движение сп-да, а другие вызывают хемотаксис, т.е. направленное движение сп-дов вверх по градиенту концентрации аттрактанта. Он показан для многих групп животных. В основном, для беспозвоночных (книдарии, моллюски, иглокожие, полухордовые). Из яиц двух видов м. ежа выделили два видоспецифических аттрактанта – сперакт и резакт –они вызывают видоспецифическое поведение сп-дов. Резакт, помещенный в каплю морской воды, где находились сп-ды, вызывал видоспецифический хемотаксис.

Контактные взаимодействия

Акросомная реакция – после контакта с первичной оболочкой яйцеклетки или после соударения сперматозоида с любой твердой поверхностью или при повышении концентрации ионов кальция. У большинства морских беспозвоночных акросомная реакция протекает в два этапа: разрыв акросомного пузырька и выдвижение акросомного выроста. У морских ежей первичная оболочка очень толстая. Её верхний слой, студенистая оболочка, состоящая из гликопротеинов, лежит поверх желточной оболочки и его функция – в привлечении или активации сп-дов. Контакт сп-дов со студенистой оболочкой вызывает разрушение акросомного пузырька и выделение протеолитических ферментов, которые прокладывают спермию путь через эту оболочку к поверхности яйца. Это происходит таким образом. Мембрана акросомного пузырька сливается с наружной мембраной сп-да. Акросомный пузырек открывается наружу (экзоцитоз) Из него изливаются спермолизины – ферменты, разрушающие студенистую оболочку. Таким образом, студенистая оболочка некоторых видов может обеспечивать видоспецифическое узнавание гамет.

Второй этап – заключается в образовании акросомного выроста. Этот вырост возникает в результате полимеризации молекул глобулярного актина и образования актиновых филаментов. Это приводит к выпячиванию внутренней мембраны акросомы. Возникает акросомная ворсинка. Она быстро растет и соприкасается с желточной оболочкой. Это решающий момент для взаимного узнавания яйцеклетки и сп-да. Происходит узнавание благодаря белку биндину, встроенного в мембрану акросомы, который соединяется с соответствующим рецептором на желточной оболочке. Желточная оболочка лизирует и на яйцеклетке образуется «бугорок оплодотворения», направленный навстречу акросомной ворсинке. Мембраны верхушки акросомной ворсинки и бугорка оплодотворения сливаются между собой и по образовавшемуся сквозному каналу содержимое сп-да переходит внутрь яйцеклетки. Это прежде всего - ядро и одна центриоль, но нередко попадает и хвостовая часть. Участок мембраны сп-да встраивается в мембрану яйцеклетки и может сохраняться длительное время и играть важную роль в последующем развитии.

Способность плазматической мембраны яйцеклетки к слиянию необходима для её соединения со сперматозоидом, однако, как только это слияние произойдет такая способность становится опасным свойством. У большинства изученных животных каждый проникающий в яйцеклетку сперматозоид снабжает его гаплоидным ядром и центриолью. При нормальном моноспермном оплодотворении, когда в яйцеклетку проникает один сперматозоид, их гаплоидные ядра соединяются, образуя диплоидное ядро оплодотворенного яйца (зиготы), при этом восстанавливается присущее данному виду число хромосом. Внесенная сперматозоидом центриоль делится и образует два полюса митотического веретена при последующем делении.

Проникновение множества спермиев – полиспермия - у большинства животных приводит к гибельным последствиям. Возникает зародыш, у которого разные клетки несут разные хромосомы, одни клетки получают лишние копии генов, а другие наоборот недополучают. Все это является причиной гибели клеток и, следовательно, самого зародыша.

Для того, чтобы этого не произошло, яйцеклетка должна защитить себя полиспермии. Она должна активироваться. Происходит реакция активации, в результате которой с клеткой происходят удивительные вещи. Активация яйцеклетки выражается в изменении обмена веществ, в кортикальной реакции и изменении ядерного аппарата яйцеклетки. Прежде всего выясним, как предотвращается полиспермия. В процессе эволюции животные выработали разные способы предотвращения полиспермии. Существует два механизма защиты от лишних сп-дов: 1.- Быстрый блок полиспермии. Рассмотрим это на примере м ежа. После проникновения первого (самого быстрого) сп-да изменяется электрический потенциал мембраны. По обе стороны е концентрация ионов значительно различается. Особенно это относится к ионам натрия и калия. В морской воде концетрация ионов натрия очень высока, а в цитоплазме –очень низка. Для ионов калия отношение обратное. Такое состояние удерживается плазматической мембраной. Она устойчиво препятствует проникновению натрия внутрь и утечке калия в окружающую среду. Таким образом существует постоянная устойчивая разность потенциалов, которая носит название мембранного потенциала покоя. Его величина -70 милливольт, что означает, что содержимое клетки заряжено отрицательно по отношению к внешней среде.

В течение одной десятой секунды после прикрепления первого спермия мембрана меняет свои электрические свойства в результате поступления в цитоплазму небольшого количества натрия, которое меняет разность потенциалов до +20мВ. Сп-ды способны сливаться с мембранами, когда у них отрицательный потенциал покоя –70мВ, но не выше. Каким образом происходит это изменение? В сп-де содержится акросомный белок, который способен открывать натриевые каналы в неоплодотворенном яйце м ежа Urechis. По-видимому, открывание натриевых каналов индуцируется прикреплением сп-да к поверхности яйца. Оплодотворение можно предотвратить, искусственно поддерживая потенциал на положительном уровне, и вызвать полиспермию – поддерживая на отрицательном.

2.-Медленный блок полиспермии. Быстрый блок полиспермии длится недолго – так как мембранный потенциал остается положительным недолго – до одной минуты. Это может быть недостаточным. Удаление прикрепившихся сверхчисленных сп-дов происходит во время так называемой кортикальной реакции.

Кортикальная реакция - наиболее явный показатель активации яйцеклетки и представляет собой экзоцитоз так называемых кортикальных альвеол.Эти многочисленные пузырьки находятся в поверхностном слое неоплодотворенной яйцеклетки. После проникновения сп-да в яйцо происходит целый каскад молекулярных событий, которые приводят к высвобождению ионов кальция из отсеков эндоплазматического ретикулума, где этот ион содержится постоянно и в высокой концентрации. В результате в цитоплазме возникает узкая волна повышенной концентрации ионов кальция, которая начинается от точки вхождения сп-да к противоположной точке поверхности яйцеклетки.Именно изменение концентрации ионов кальция стимулирует экзоцитоз кортикальных альвеол.

При экзоцитозе из альвеол высвобождаюся в узкое пространство между плазматической мембраной и плотно примыкающей к ней желточной оболочкой протеолитический фермент. Он разрывает связи между плазматической мембраной и желточной оболочкой. Этот фермент называется вителлиновой деламиназой. Кроме этого выделяется протеолитический фермент, освобождающий осевших на желточной оболочке сп-дов от связей с этой оболочкой. Этот фермент называется сперм-рецепторная гидролаза. В это же время выделяется гликопротеид, который втягивает воду в пространство между желточной оболочкой и плазматической мембраной. В результате возникает обширное перивителлиновое пространство. Это самый четкий признак активации яйцеклетки. Желточная оболочка затвердевает также под воздействием выделенных из яйцеклетки факторов и становится оболочкой оплодотворения. Она надежно защищает от проникновения лишних сперматозоидов. И самое последнее, что происходит при кортикальной реакции – выделение на поверхности плазматической мембраны тонкого но плотного гиалинового слоя. В этом участвует белок гиалин, тоже хранящийся в кортикальных альвеолах. Гиалиновый слой будет очень нужен во время последующего деления, так как он укрепляет стенки делящихся клеток.

Одновременно в кортикальном слое происходят сборка и перераспределение элементов цитоскелета. Он приобретает свойство сократимости, что будет очень нужно для последующего деления.

Все описанные сложные и многоплановые процессы, составляющие реакцию активации яйцеклетки, происходят в считанные секунды и минуты. Они обеспечиваются синтезом белков который идет на матрицах, запасенных в оогенезе. Молекулы мРНК сохранялись в виде информосом. Огромное количество рибосом также было запасено в в оогенезе. В этом случае синтез белков идет на уровне трансляции.

Ооплазматическая сегрегация

Непосредственно после проникновения сп-да или под воздействием партеногенетического агента в яйцеклетке начинаются интенсивные перемещения цитоплазмы (ооплазмы).При этом может происходить расслоение, отмешивание различных составных частей ооплазмы. Всё это называется ооплазматической сегрегацией. В ходе сегрегации намечаются основные элементы пространственной организации зародыша. (Рис.) Ооплазматическая сегрегация у различных видов выражается по-разному.

У кишечнополостных –сегрегация состоит в расслоении ооплазмы на внешний поясок – эктоплазму часто окрашенную различными пигментами и бедную питательными веществами, и на внутреннюю массу цитоплазмы, богатую питательными веществами и потому кажущуюся мутной.

У брюхоного моллюска – прудовика – после оплодотворения на вегетативном полюсе формируется четко отграниченный сектор так называемой полярной плазмы, а затем она растекается под поверхностью яйцеклетки в направлении анимального полюса.

У морского ежа до оплодотворения под всей поверхностью яйцеклетки рассеян красный пигмент – эхинохром. После оплодотворения он локализуется в экваториальной зоне.

У асцидий в неоплодотворенных яйцеклетках содержится по всему кортикальному слою желтые гранулы. После оплодотворения они располагаются в виде желтого серпа под экватором. А на другой стороне формируется другой серп, состоящий из светлого серого вещества. Таким образом после оплодотворения яйцеклетка асцидий окрашена в разные цвета. Вегетативное полушарие богато желтком и митохондриями – оно мутно-белесоватого цвета, анимальное состоит из прозрачной цитоплазмы. По экватору располагаются два серпа, один желтый, другой серый. Каждый из этих отделов сегрегированной цитоплазмы даст начало определенным структурам. Желтый – мезодерме, серый – хорде, Анимальное полушарие – эктодерме, а вегетативное –энтодерме.

В яйцеклетках амфибий вдоль экватора выделяется серый серп, продолжением его является поясок. Эти процессы полностью осуществляют пространственную разметку будущего организма. Та сторона где вошел сп-д, станет брюшной, а противоположная – там где расположена широкая часть серпа – спинной. Анимальное полушарие даст покровную ткань и нервную систему. Вегетативная часть – кишечник. Узкая часть серого серпа даст мышцы, кровь, кости, большинство внутренних органов, а широкая его часть – хорду, очень важное образование. У некоторых животных она остается всю жизнь, у других, выполнив очень важные функции в эмбриогенезе, она резорбирует.

В последнее время было показано, что решающим для местоположения серого серпа в яйцеклетке амфибий является так называемый поворот оплодотворения. Кортикальный слой поворачивается на 30 градусов относительно всей остальной массы цитоплазмы. Та сторона, с которой частички кортикального слоя уходят, становится брюшной (вентральной) стороной зародыша, а на которую поднимаются – спинной или дорзальной. Поскольку анимальная часть яйцеклетки пигментирована, а вегетатативная – нет, то наплыв более светлой вегетативной плазмы на пигментированную анимальную вызывает некоторое просветление пограничной экваториальной зоны, которая и видна в виде серого серпа. Асимметрично перераспределяется и наиболее тяжелая фракция желтка. Она опускается на самый вегетативный полюс.

Для осуществления поворота оплодотворения необходимы микротрубочки. Они организуются около асимметрично расположенной в цитоплазме яйцеклетки отцовской центриоли и наиболее активно растут по направлению к вегетативному полюсу. Их вегетативные концы при контакте с плазматической мембраной изгибаются в сторону будущей дорзальной стороны. В этом же направлении перемещается и связанный с ними «моторный белок» - кинезин. Он способен перемещать везикулярные пузырьки с различными веществами, в том числе и содержащие особый белок “dishevelled” (растрепанный, всклокоченный, взъерошенный), который попадает в область серого серпа и затем будет играть важную роль в последующих морфогенетических событиях.

В яйцеклетках ряда животных для ооплазматической сегрегации важное значение имеет сократимость актиновых филаментов кортикального слоя, активируемая ионами кальция. В яйцеклетке асцидий можно вызвать появление желтого серпа в любом месте, если приложить к нему вещество, делающее поверхность проницаемой для ионов кальция – кальциевый ионофор. Кроме того в ооплазматической сегрегации определенную роль играет своеобразное явление взаимного сродства гомологичных внутри-клеточных структур: желточных гранул друг к другу, митохондрий и т.п. Из-за этого возникают зоны с преимущественным содержанием того или иного компонента.

Изменения в ядерном аппарате яйцеклетки. У большинства животных оплодотворение начинается до завершения оогенеза. В связи с тем, что оплодотворение может происходить на разных стадиях оогенеза, различаются 4 типа оплодотворения. (Рис. –Схема оогенеза).

1. Сп-д проникает в яйцеклетку на стадии ооцита 1го порядка в профазе мейоза (у круглых червей), тип аскариды. Удивительным образом сюда же относятся три представителя млекопитающих – лиса, собака, лошадь.

2. На метафазе 1го деления созревания (у моллюсков) – тип моллюсков.

3. На метафазе 2го деления созревания (у большинства позвоночных, в частности подавляющее большинство млекопитающих).

4. После окончания делений созревания, т.е. на стадии зрелого яйца. (у иглокожих).

Таким образом оплодотворение побуждает яйцеклетку к созреванию. Если оплодотворения нет, яйцеклетки погибают.