Сырье, оборудование, приборы:

– сухой протеолитический фермент (культура гриба);

– лабораторная посуда (стаканы, колбы, пробирки, пипетки градуированные, воронки, мерные колбы на 100 мл);

– штатив для пробирок вместимостью 20 мл;

– фильтровальная бумага (фильтры);

– секундомер;

– ультратермостат;

– термометры со шкалой от 0 до 100ºС;

– ФЭК с использованием кювет с шириной грани 10мм и светофильтры с длиной световой волны 656-670 нм;

А также реактивы:

– субстрат 2%-ный раствор казеината натрия;

– универсальные буферные растворы с рН от 1,8 до 12: 0,1М, 0,5М, 0,01М;

– 0,3М раствор трихлоруксусной кислоты;

– 1,0н и 0,2н растворы НCl;

– 0,5М раствор Na²CO³;

– реактив Фолина;

– ферментый раствор.

Порядок выполнения работы

Первоначально готовят рабочий ферментный раствор путем растворения ФП в 0,1М универсальном буферном растворе. При анализе кислых протеаз используют растворы с рН 2,5 и 5,5; нейтральных – с рН 7,5 и щелочных – с рН 9,5;

На аналитических весах отвешивают 0,1-1,0г исследуемого препарата, тщательно растирают его стеклянной палочкой в стаканчике вместимостью 50 мл с небольшим количеством буферного раствора. Затем содержимое стаканчика количественно переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят этим же универсальным буферным раствором объем жидкости до метки. Из полученного раствора готовят рабочий раствор, разбавляя его универсальным буферным раствором до необходимой концентрации с таким расчетом, чтобы в реакционной среде был избыток субстрата, а измеряемые оптические плотности при колориметрировании находились в пределах от 0,10 до 0,75.

Ферментативный гидролиз субстрата под действием исследуемого фермента проводят по следующей схеме:

В несение 2 мл субстрата в пробирку вместимостью 20 мл

Выдержка в ультратермостате при 30ºС в течение 5-10 мин.

Д обавление 2 мл рабочего ферментного раствора, перемешивание

Выдержка 10 мин при 30ºС

Внесение 4 мл 0,3 М раствора трихлоруксусной кислоты для инактивации фермента и осаждения продуктов гидролиза, перемешивание

Выдержка 20 минут при 30ºС для обеспечения полноты осаждения

Фильтрация через бумажный складчатый фильтр в сухую пробирку

Внесение 1 мл фильтрата в сухую пробирку и добавление 5 мл 0,5М раствора карбоната натрия, перемешивание и добавление при непрерывном перемешивании 1 мл рабочего реактива Фолина

В ыдержка при комнатной температуре в течение 20 минут для получения комплексных соединений, обуславливающих голубой цвет раствора

Измерение интенсивности окрашивания раствора на приборе ФЭК.

Контрольный раствор для сравнения при колориметрировании готовят параллельно с опытным и получают по схеме:

Приливают к 2 мл ферментного раствора того же разведения

4 Мл 0,3м раствора трихлоруксусной кислоты

В ыдерживают в ультратермостате при 30 ºС 10 минут

Д обавляют 2 мл субстрата, перемешивают

Выдерживают 20 минут в ультратермостате для обеспечения полноты осаждения и инактивации фермента

Фильтруют раствор, отбирают в сухую пробирку 1 мл фильтрата

Вносят при перемешивании 5 мл раствора карбоната натрия и 1 мл рабочего раствора реактива Фолина

Используют для сравнения при колориметрировании опытного раствора

Колориметрирование производят на приборе ФЭК, используя кюветы с шириной грани 10мм и светофильтр с длиной световой волны 656-670 нм.