Совместная работа студента с преподавателем

Самостоятельная работа студентами выполняется под непосредственным контролем преподавателя. После выполнения задания студенты должны представить тетради на проверку преподавателю и отдать лаборанту для обработки использованную лабораторную посуду.

Контрольные вопросы:

1. Как правильно готовят препарат из выращенных на питательной среде колоний?

2. Как и для чего осуществляется техника микроскопирования?

3. Какие признаки отдельных колоний микроорганизмов можно определить с помощью микроскопа?

4. Какие еще свойства и признаки определяют для полной идентификации отдельных колоний микроорганизмов?

5. Что такое колония? Чистая куль тура? Штамм?

6. Как осуществляется выделение чистой культуры?

7. Перечислите правила хранения чистых куль тур.

Лабораторная работа № 4

«Первичный скрининг микроорганизмов-продуцентов антибиотиков

среди бактерий, актиномицетов и грибов»

Тема занятия: Первичный скрининг микроорганизмов-продуцентов антибиотиков среди бактерий, актиномицетов и грибов

Цель: Ознакомиться с факторами, влияющими на синтез и накопление антибиотиков различными продуцентами (бактериями, актиномицетами, грибами), освоить основные принципы управлениями этими факторами.

Задачи обучения:

• научиться оперировать понятиями первичного и направленного скрининга;

• научиться анализировать и применять методы выделения микроорганизмов из почвы и проведения скрининга БАВ.

• Знать схему выделения микроорганизмов-продуцентов антибиотиков из природных источников; основные этапы скрининга;

• Знать методы оценки способности микроорганизмов продуцировать вещества, обладающие биологической активностью.

• Уметь готовить почвенную суспензию (взвеси);

• делать посев на агаризованные среды;

• работать с микроскопом;

• различать продуценты антибиотиков по морфологическим признакам;

• оценивать особенности кульуральной жидкости.

ЗАДАНИЕ 1. Приготовить ферментационную среду М-1 для первичного скрининга антибиотиков среди бактерий и актиномицетов

ЗАДАНИЕ 2. Приготовить ферментационную среду А-9 для первичного скрининга антибиотиков для грибных культур

Особенности биосинтеза микроорганизмов-продуцентов антибиотиков

Микроорганизмы синтезируют антибиотики при росте как на агаризованных средах, так и в условиях погружения в жидкую питательную среду. Антибиотики являются вторичными метаболитами, которые обычно образуются в ответ на пищевой дефицит. Основные факторы, влияющие на образование антибиотиков микроорганизмами: состав питательной среды и условия культивирования. Главная задача при получении антибиотика – создание условий, при которых микроорганизм быстро наработает значительную биомассу и начнет синтез антибиотиков.

В Государственном научном центре антибиотиков (Москва) с использованием математических методов были разработаны универсальные ферментационные среды для проведения поисковых работ среди бактерий, актиномицетов и грибных культур.

Состав ферментационной среды М-1 для первичного скрининга антибиотиков среди бактерий и актиномицетов, %:

• Гороховая мука – 1,5;

• сахароза – 2,1;

• крахмал – 0,85;

• NaNO₃ – 0,5;

• CaCO₃ – 0,5;

• вода водопроводная, рН от 7,2 до 7,4.

Состав ферментационной среды А-9 для грибных культур, %:

• меласса – 2,0;

• соевая мука – 2,5;

• К₂НРО₄ – 0,5;

• глицерин – 3,0;

• соль поваренная – 0,5.

Среды разливают по 100 мл в колбы Эрленмейера объемом 750 мл, закрывают ватно-марлевыми пробками сверху пергаментной бумагой, которую закрепляют тесьмой. Стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 ºС и давлении 0,8 атм. Засев колб осуществляют культурой, выросшей на плотной агаризованной среде. Микробиологическим крючком вырезают агаровый блок размером 1 см³ и переносят в колбу с ферментационной средой. Засев проводят в стерильном боксе около пламени горелки. Продуцент в жидкой питательной среде в колбах культивируют в термостатируемой комнате на качалке при 180-220 об/мин. Ферментацию для бактерий и актиномицетов обычно проводят при 28 ºС; для грибных культур – при 24 ºС (до следующего занятия).

Порядок выполнения работы

• Приготовление почвенной взвеси: взвешивают 1 г почвы, помещают в колбочку со 100 мл стерильной водопроводной воды. Встряхивают смесь на шуттеле или вортексе в течение 10 мин, затем отстаивают еще 10 мин для осаждения неразбитых комочков почвы.

• Заранее приготовленную, стерильную агаризованную среду Гаузе 1 расплавляют на водяной бане, остужают до 45-50 ⁰ С и разливают в стерильные чашки Петри.

• Готовят разведения почвенной суспензии до 10-5-10-7 в воде.

• Пробу в количестве 0,5 мл из полученного разведения наносят на поверхность агаризованной среды в 3 чашках Петри. Стерильным шпателем суспензию растирают по поверхности агара.

• Засеянные чашки помещают в термостат (инкубируют при 28 ⁰ С 14 сут).

• Проводят визуальную оценку микроорганизмов, выросших на агаризованных средах после высева различных образцов почвы (приготовлены заранее преподавателем).Оценивают разнообразие выросших микроорганизмов.

• При помощи микробиологической петли на скошенный агар в пробирки выделяют 2-3 колонии.

• Проводят оценку морфологической специфики коллекции культур микроорганизмов в пробирках.

• Готовят мазки различных культур на предметных стеклах, которые фиксируют и окрашивают метиленовой синью или по Граму.

• Готовые мазки просматривают под микроскопом.