4.8 Гены инактивированные метилированием в опухолях
Метилирование ДНК является важным элементом контроля экспрессии генов в клетках млекопитающих. Это регулируемый процесс и предполагается, что он играет важную роль в регуляции экспрессии генов в процессе развития и дифференцировки.
В сложных организмах метилирование ДНК обеспечивает механизм выключения больших групп генов в клетках определенного типа. Это выключение носит стабильный характер и наследуется данным типом клеток при делении. Метилированными в ДНК оказываются множество сайтов. Но только малая доля их вовлекается в регуляцию транскрипции. Чаще всего метилирование промоторной части гена приводит к подавлению его экспрессии, хотя это правило соблюдается не в 100% случаев.
Метилирование остатков цитозина может оказывать влияние на транскрипцию как непосредственно через изменение эффективности связывания позитивных и негативных факторов транскрипции со своими регуляторными участками на ДНК, так и опосредованно через формирование неактивных в транскрипционном отношении участков хроматина. Поскольку 5-mC структурно подобен тимину, метилирование остатков C может сопровождаться возникновением новых консенсусных последовательностей для некоторых факторов транскрипции. В частности, метилирование превращает низкоаффинный сайт связывания фактора транскрипции AP-1 (CGAGTCA) в высокоаффинный сайт (mCGAGTCA), который соответствует консенсусному сайту для этого фактора (TGAGTCA). Известные промоторы, за небольшим исключением (например, промотора гена главного комплекса гистосовместимости H-2K), неактивны в метилированном состоянии. Единственная метильная группа, введенная в промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или в С-промоторы вируса Эпштейна-Барр , может оказывать большое негативное влияние на транскрипцию. Уровень подавления активности других промоторов, в частности, промоторов альфа- и гамма-глобиновых генов человека или промотора мышиного гена MyoD1 , находится в прямой зависимости от числа введенных в них метильных групп, но не от их положения в промоторах. Ингибирование транскрипции, вызванное частичным метилированием промоторов, может преодолеваться с помощью энхансеров, однако полностью метилированные промоторы не реактивируются энхансерами и сохраняют свое репрессированное состояние, несмотря на присутствие последних. На основании такого рода данных высказывается предположение, что метилирование ДНК регулирует транскрипцию по принципу "все или ничего" и не обеспечивает тонкой регуляции экспрессии генов[10].
В возникновение опухолей человека и их прогрессию вносят вклад как генетические, так и эпигенетические события, причем удельный вес тех и других в каждом конкретном случае варьирует в широких пределах. Иллюстрация этого положения на примере генов-супрессоров p16 и гена р15 приведена на рис.3.
Рис.3. Вклад генетических и эпигенетических событий в опухолеобразование [3].
Ген p16 кодирует конститутивно экспрессируемый ингибитор циклинзависимой киназы. Белок р16 играет ключевую роль в контроле клеточного цикла, блокируя сигнальный путь циклин-D-Rb. Утрата этого белка или его инактивация ведут к тому, что клетка теряет контроль над клеточным циклом: циклинзависимая киназа фосфорилирует Rb, в результате чего из неактивного комплекса высвобождаются факторы транскрипции E2F. В итоге активируются гены, обусловливающие вхождение клетки в фазу S клеточного цикла. Повреждения или делеции этого гена так часто регистрируются в опухолях самого разного происхождения, что возникло представление о нем как о наиболее часто поражаемом при канцерогенезе гене-супрессоре. Гиперметилирование CpG-островка в 5'-области этого гена составляет по разным данным от 20 до 67% солидных опухолей человека разной локализации.
К группе “генов общего контроля” относят и те гены-супрессоры, продукты которых не входят в системы репарации ДНК непосредственно, а принимают участие в организации “контрольного пункта” проверки ДНК перед переходом клетки к следующей стадии клеточного цикла, обеспечивающего две основных контролирующих функции: 1) проверку того, что предыдущая стадия завершена полностью, и 2) в случае необходимости создания возможности для прохождения репарации ДНК перед началом репликации. В частности, это означает, что разрывы в цепи ДНК приводят к задержке клеточного цикла в фазе G1, препятствуя переходу клетки в фазу S. Ключевую роль в этом процессе играет один известный ген-супрессор – p53, мутации или делеции которого наблюдали примерно в 50% всех злокачественных заболеваний [9]. Ген р53 картирован и клонирован на коротком плече хромосомы 17р13 и занимает 200 т.п.н. геномной ДНК, состоит из 11 экзонов, первый из которых является некодирующим. Ген кодирует мРНК длиной 2,8 тысяч нуклеотидов. Белок массой 53Кда является фосфопротеином и состоит из 393 аминокислот.
Белок р53, функционирующий в виде тетрамера, связывается с убиквитином при участии фактора MDM2 и подвергается деградации (см.Рис.3). Белок р19/ARF, экспрессия которого увеличивается под действием онкостимулами типа E1a, V-abl, myc, нарушает это связывание и предотвращает деградацию р53. Также ингибитором этого связывания является продукт гена АТМ, повреждения которого вызывают атаксию-телангиоэктазию. Белок p53 способен функционировать также как активатор транскрипции. Показано, что множественные повреждения ДНК вызывают экспрессию гена p53 [7], который, в свою очередь, активирует транскрипцию гена р21/WAF1, кодирующего ингибитор циклин-зависимых киназ CIP1. CIP1 избирательно подавляет активность циклин D1/CDk4 и циклин E/CDk2-комплексов, что и приводит к задержке перехода клетки из фазы G1 в фазу S (см.Рис.4).
Рис.4. Схема действия белка р53 [5].
Запускающая этот каскад индукция p53 происходит в ответ на любые неспецифические, повреждающие ДНК, воздействия, такие как ионизирующая радиация, свободные радикалы, действие эндонуклеаз рестрикции [5]. Одновременно с подавлением репликации ДНК, белок p53 стимулирует ее репарацию, активирует транскрипцию гена GADD45, а также связывается с белком ERCC3, непосредственно участвующем в распознавании и вырезании поврежденных участков ДНК.
Герминальные миссенс-мутации гена-супрессора p53 приводят к довольно редкому синдрому Ли-Фраумени, при котором типичными являются опухоли мозга, мягкотканные саркомы различной локализации, остеосаркомы, лейкемия и карциномы молочной железы. Выявлена кластеризация мутаций в районе 14 кодонов (245-258). В то же время различные повреждения гена выявляют практически во всех типах опухолей. Частота миссенс-мутаций гена составляет 74%, сдвига рамки считывания - 11%, нонсенс-мутаций - 7%, мутаций сайта сплайсинга - 4%. Определено 7 “горячих” точек, повреждаемых мутациями: кодоны 130-142, 151-164, 171-181, 193-200, 213-223, 234-258 и 270-286, причем все они локализованы в эволюционно консервативном ДНК-связывающем домене, кодируемом экзонами 5-8. Мутации кодонов 157 и 179 наиболее часто выявляются при раке легкого, кодона 175 - при раке толстого кишечника, кодона 248 - при сквамозных карциномах головы и шеи, кодона 249 - при гепатокарциноме и кодона 278 - при опухолях кожи [3].
Этот ген, играющий чрезвычайно важную роль хранителя генома, нарушения которого идентифицированы не менее чем в половине случаев рака человека, не содержит в своей промоторной части СрС-островка. Следовательно, феномен MAGI на него не распространяется. Тем не менее, вклад метилирования в инактивацию р53 велик, но обусловлен он в этой ситуации не эпигенетическим (как в большинстве случаев), а генетическим механизмом. Одиночные и метилированные динук-леотиды CpG, в значительном числе присутствующие в теле гена, в силу своей гипермутабильности способствуют возникновению замен пары G-C на А-Т (примерно треть из более, чем 300 мутаций, зарегистрированных в гене р53, принадлежит к этому типу).
Ген р73 , содержащий в промоторной части большой и типичный CpG-островок, редко обнаруживает мутации, столь типичные для р53. Гиперметилирование этого гена обнаружено при остром лимфобластном лейкозе и лимфомах.