1.2 Метилирование днк генома млекопитающих

Общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК метилирована, т.е. находится в форме 5-метилдезоксицитидина. Экспериментальное изучение характера метилирования основано на сопоставлении рестрикционных фрагментов, образующихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того, находится ли это основание в метилированном состоянии или нет. В частности, рестриктазы Mspl и HpaII узнают последовательность ССGG, но, в отличие от Mspl, HpaII не расщепляет ДНК в тех сайтах, где внутренний СрG-динуклеотид метилирован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в местах 5'-ССGG-3' и частично метилированы в 5'-GСGС-3' - сайтах рестрикции для Hhal. В других сегментах наблюдается характерный рисунок частичного метилирования в 5'-ССGG-3' последовательностях. Различные индивидуумы, независимо от их этнического происхождения, практически не различаются по характеру метилирования ДНК в одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогенетической дифференцировки происходят значительные изменения рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опухолевого происхождения число метилированных сайтов резко уменьшено. Высказано предположение о наличии прямой связи между метилированием ДНК и состоянием генетической активности в клетках.

Существует класс белков, которые специфическим образом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, возможно, и для полимераз.

Получено много прямых экспериментальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а значит, и в регуляции активности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области генов, в особенности СрG-островков , как правило, свидетельствует о функциональной активности генов. Показано, что необычные структуры в молекуле ДНК, как и экзогенная ДНК, встроившаяся в процессе генетической трансформации, нередко подвергаются метилированию.

Известно, что метилирование играет важную роль в инактивации Х-хромосомы у самок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (геномного) импринтинга, связанного с различной пенетрантностью некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, т. е. прохождения через материнский или отцовский гаметогенез.

1.3 Распределение CpG динуклеотидов в геноме человека

В клетках млекопитающих главное основание ДНК, подвергаемое энзиматическому метилированию - цитозин. Основной мишенью метилирования в цепях ДНК служит последовательность CpG . Динуклеотиду CpG в одной нити ДНК соответствует тот же динуклеотид в противоположной нити (в силу их комплементарности и антипараллельности). Это облегчает функцию поддерживающего метилирования, вступающего в действие сразу после репликации ДНК и воссоздающего профиль метилирования дочерней нити по образцу материнской. Количество и распределение динуклеотидов CpG в геноме - факторы, имеющие большое значение для понимания функции метилирования ДНК.

1.4 CpG-супрессия

5-Метилциитозин гипермутабелен, (поскольку аминогруппа в положении 6 крайне нестабильна) и может подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием тимина. Это обстоятельство вело в процессе эволюции к многочисленным заменам пар G-C на А-Т, в результате чего в геноме человека динуклеотидов CpG в ~5 раз меньше (частота ~1 динуклеотид на 80), чем следовало бы (1 на 16). Это явление получило название CpG- суппрессии.

1.5 CpG-островки

В GC богатых изохорах локализовано большое количество СрG- островков- последовательностей от 500 до 2000, характеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина (G+С более 60%), представленных в виде кластеров неметилированных СрG-дуплетов и так называемых G/С-боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Spl - (G)4С(G)4С. СрG-островки содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих неметилированные СрG-дуплеты. В частности, более 80% Nor 1-сайтов связано с СрG-богатыми островками.

Характерным свойством CpG-островков является их локализация вблизи структурных генов, преимущественно в их 5'-участках (регуляторные последовательности, промоторы, последовательности первого экзона). Анализ полностью расшифрованных к настоящему моменту нуклеотидных последовательностей хромосом 21 и 22 человека подтверждает это общее положение. Формальные признаки CpG-островков (присутствуют в промоторных зонах примерно 60% генов человека):

- размеры от 0,5 до 5 тыс. пар оснований;

- встречаемость примерно 1 на 100;

- обычное (т.е. соответствующее расчетному 1:16) содержание CpG динуклеотида;

- С + G превышает 60%; отношение CpG/GpC не менее 0,6.

За несколькими известными исключениями (см. выше) CpG-островки не метилированы во всех типах тканей независимо от экспрессии соответствующего гена. С этой точки зрения важен вопрос о пространственной соотношении структурных генов и CpG-островков. Примерные расчеты свидетельствуют о том, что свыше половины генов, составляющих функционирующий геном человека. содержат CpG-островки: они имеются, по-видимому, у всех генов, выполняющих базовые клеточные функции ( генов домашнего хозяйства), и у примерно 40% генов, выполняющих специализированные функции. Значительная часть тканеспецифических генов не имеет в своих промоторах CpG- островков: вместо них могут присутствовать одиночные CpG-динуклеотиды.

Наибольшая плотность СрG-островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9 , 15, 16, 17 ,19, 20 ,22. Точные молекулярные методы регистрации СрG-островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45 000.