2.3 Необходимость метилирования днк у эукариот

О важной роли метилирования свидетельствует, что гомозиготная делеция Dnmt1 у мышей ведет к летальному исходу на эмбриональной стадии развития. Это наблюдение явилось решающим доказательством необходимости метилирования ДНК у высших эукариот. На этой же модели получены доказательства давно предполагавшейся связи между метилированием ДНК и блокированием экспрессии метилированных генов.

Другим доказательством связи блока транскрипции с феноменом метилирования ДНК служат опыты с аналогом цитидина 5-азацитидином. Последний включается в реплицирующуюся ДНК и в силу своей химической структуры (N вместо С в позиции 5) не может быть метилирован. Его деметилируюшее ДНК действие, однако, в большей степени обусловлено тем, что 5-азацитидин служит "ловушкой" для ДНК- метилтрансферазы и блокирует ее активность.

Во многих случаях продемонстрирована возможность транскрипционной реактивации метилированных генов и генетических конструкций после применения 5-азацитидина как деметилирующего агента. Более того, этот тест в ряде случаев является решающим свидетельством вовлечения метилирования в тот или иной фенотипический признак. Его ограничением, однако, является возможность побочных эффектов [8].

2.4 Dnmtl: днк-метилтрансфераза 1 белок и Dnmt3: днк-метилтрансфераза 3 белок

Dnmtl- наиболее изученный сегодня фермент системы метилирования ДНК у позвоночных. О важной функциональной роли этого фермента свидетельствует то обстоятельство, что гомозиготная делеция Dnmt1 у мышей ведет к летальному исходу на эмбриональной стадии развития. ДНК-метилтрансфераза 1 - белок с молекулярной массой ~190 кДа, в котором выявлены два домена: каталитический, расположенный в С-концевой трети белка и структурно-близкий бактериальным цитозиновым метилтрансферазам, и регуляторный, расположенный в N-концевой части и содержащий сигнальную последовательность, направляющую фермент в активные репликативные комплексы в делящихся клетках.

Ферментативная активность Dnmtl резко возрастает с началом синтеза ДНК. Возможно, это обусловлено тем, что промотор Dnmtl активируется продуктом гена H-ras, участвующим в одном из главных путей переноса митогенного сигнала.

Репликативный комплекс включает в себя и ДНК-метилтрансферазу 1, благодаря чему в первые минуты после репликации профиль метилирования дочерней нити ДНК воссоздается по образцу материнской. Вместе с тем слабая способность ДНК-метилтрансферазы 1 метилировать ДНК de novo (наибольшую активность этот фермент проявляет по отношению к полуметилированным матрицам, т.е. к ДНК, одна нить которых уже метилирована и тот факт, что в клетках с нокаутированным геном Dnmtl метилирование de novo трансфицированной ДНК все же происходит, заставляют усомниться в том, что наряду с поддерживающим метилированием Dnmtl способна осуществлять и метилирование de novo. Клонированы гены, продукты которых проявляют высокую способность метилировать ДНК de novo и которые, возможно, ответственны за этот процесс in vivo.

Две ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a и Dnmt3b, необходимы, как оказалось, и для метилирования de novo, и для эмбрионального развития мыши. Инактивация соответствующих генов несовместима с развитием зародыша, блокирует реакцию de novo, но в то же время не оказывает влияния на поддерживающее метилирование импринтированных генов. Мишенями Dnmt3a и Dnmt3b являются, по-видимому, разные участки генома. Функции четвертого фермента Dnmt2 пока неясны.