1.2 Бисульфитный метод и постановка амплификации. Определние гиперметилирования генов pten, mgmt, p16.

1. Выделяют ДНК из опухолевой ткани (любым методом). Примеры методов выделения ДНК представлены выше.

2. Проводят бисульфитную конверсию (набором Qiagen Bisulfite Kit)

Подготовительный этап:

1. Разводят буфер BW 30 мл спирта (96-100%) и хранят при комнатной температуре.

2. Разводят буфер BD 27 мл спирта (96-100%) и хранят в холодильнике.

3. Разводят лиофилизированный carrier RNA 310мкл dH₂О и храняь при -20С.

4. Готовят смесь разведенной carrier RNA с буфером BL из расчета и хранят в холодильнике (см.Табл.2).

5. Protection буфер хранят в холодильнике, а остальные реагенты при комнатной температуре.

Таблица 2.

Объём BL и разведенной carrier RNA и число образцов

Число образцов	2	6	8	10	16
Объем BL	620мкл	1,86мл	2,5мл	3,2мл	5мл
Объем разведенной carrier RNA	6,2мкл	18,6мкл	25мкл	32мкл	50мкл

Бисульфитная конверсия:

1. Разводят одну пробирку Bisulfite mix 800 мкл dH₂О (на 8 образцов) и хранят в холодильнике 2 недели.

2. Готовят смесь по схеме (см.Табл.3):

Таблица 3.

Смесь для бисульфитной конверсии

Компоненты	Объем (мкл)
Раствор ДНК 280-300 нг	До 20
dH2О	До 20
Bisulfite mix	85
Protection буфер	35
Общий объем	140

3. Вортексируют, весь раствор должен быть голубым.

4. Осуществляют постановку конверсии (см.Табл.4).

Таблица 4.

Этапы метода

Шаг	Время (мин)	Температура (С)
Денатурация	5	95
Инкубация	25	60
Денатурация	5	95
Инкубация	85	60
Денатурация	5	95
Инкубация	175	60
	∞	20

Отмывки:

1. Центрифугируют, чтобы убрать конденсат. Переносят образцы в чистые эппендорфы объемом 1,5.

2. Вносят 310 мкл свежего буфера BL+, вортексируют, центрифугируют.

3. Вносят 250мкл спирта (96-100%), вортексируют 15 сек, центрифугируют. Переносят смесь на колонки. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат

4. Вносят 500 мкл буфера BW. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат.

5. Вносят 500 мкл буфера BD. Инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат.

6. Вносят 500 мкл буфера BW. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат.

7. Вносят 500 мкл буфера BW. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат.

8. Помещают колонки в новые Collection tubes. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат. Можно подсушить 5 мин при 56 С.

9. Помещают колонки в чистые эппендорфы объемом 1,5. Вносят 20 мкл EB буфера в центр мембраны. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов [13, 14].

Таблица 5.

Праймеры MGMT, Р16, PTEN

Праймеры	Последовательность
MGMTf неметилированный	5’-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3’
MGMTr неметилированный	5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3'
MGMTf метилированный	5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'
MGMTr метилированный	5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'
First PCR: Р16Мf метилированный	5′ -TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CG-3'
Р16М2r метилированный	5′ -CCA CCT AAA TCG ACC TCC GAC CG -3'
Second PCR: Р16Мf метилированный	5′ -TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CG-3'
Р16М2r метилированный	5′ -GAC CCC GAA CCG CGA CCG TAA-3'
First PCR: Р16Uf неметилированный	5′-TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TG-3
p16U2r неметилированный	5′-CCA CCT AAA TCA ACC TCC AAC-3'
Second PCR: p16Uf неметилированный	5′-TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TG-3'
p16Ur неметилированный	5′-CAA CCC CAA ACC ACA ACC ATAA -3'
PTENf метилированный	5'-TTCGTTCGTCGTCGTCGTATTT-3'
PTENr метилированный	5'-GCCGCTTAACTCTAAACCGCAACCG-3'
PTENf неметилированный	5’-GTGTTGGTGGAGGTAGTTGTTT-3’
PTENr неметилированный	5'-ACCACTTAACTCTAAACCACAACCA-3'

Следующий этап – это определние гиперметилирования генов PTEN, MGMT, p16 (примеры праймеров MGMT, Р16, PTEN в табл.5):

PTEN. Используют праймеры по 2 мкл. (Met F, Met R, Nmet F, Nmet R), ДНК 8,5 мкл., амплификационная смесь 12,5 мкл.

Програма амплификации:

1.95º - 5 мин.

2. 94º- 10 сек.; 62º - 10 сек.; 72º - 10 сек. (№2 повторить 40 раз).

3. 72º - 2 мин.

4. 10º - 10 мин.

MGMT. Используют праймеры по 2 мкл. Met F, Met R, Nmet F, Nmet R), ДНК 7 мкл., амплификационная смесь 12,5 мкл., 1,5 мкл. dH²O.

Програма амплификации:

1.95º - 5 мин.

2. 95º- 10 сек.; 59º - 10 сек.; 72º - 10 сек. (№2 повторить 40 раз).

3. 72º - 2 мин.

4. 10º - 10 мин.

р16. Используют праймеры по 2 мкл. Met F, Met R, Nmet F, Nmet R), ДНК 7 мкл., амплификационная смесь 12,5 мкл., 1,5 мкл. dH²O.

Програма амплификации:

1.95º - 3 мин.

2. 95º- 10 сек.; 65º - 10 сек. для метилированных; 58º - 10 сек. для неметилированных; 72º - 10 сек. (№2 повторить 40 раз).

3. 72º - 2 мин.

4. 10º - 15 сек.

Далее благодаря электрофорезу осуществялют оценку и сравнение метилированных и неметилированных участков ДНК, т.е. исследовать статус метилирования отдельных генов (см.Рис.5):

Рис.5. Определение гиперметилированных участков.

Гиперметилированные участки при УФ свете будут светиться (пример на прямоугольнике 1). Неметилированная ДНК (прямоугольник 2) при УФ свете будет светиться вся равномерно.