Методика фарбування простим методом

Прості методи фарбування для ідентифікації мікроорганізмів використовують в певних обставинах:

• біологічні особливості даного мікроорганізму не дозволяють використовувати загальноприйняті складні методи фарбування (мікоплазмози);

• при взаємодії з одним барвником клітина мікроба фарбується нерівномірно, внаслідок чого при мікроскопії спостерігаються спеціфічні ознаки даної клітини, такі як біполярне або зернисте фарбування.

Методика фарбування простим методом здійснюється за такою схемою:

1. Фіксований препарат кладуть на містки, розміщені на стінках кювети або кристалізатора.

2. Заливають мазок фарбуючим розчином на 1-3 хв.

Барвник можна також наливати на мазок, вкритий фільтрувальним папером. Якщо барвник підсихає, на мазок наливають нові порції розчину.

Також можна використовувати фільтрувальний папір, просочений розчином барвника (економія реактиву). В такому випадку на пофабований папір, накладений на мазок, наливають воду. Через декілька хвилин фільтрувальний папір знімають.

3. Препарат промивають водою (при потребі)

4. Фарбований препарат висушують на повітрі або обережно промокають фільтрувальним папером.

В правильно виготовленому препараті поле зору прозоре і чисте, а пофарбовані – тільки клітини мікроорганізмів.

Фарбований препарат після просушування можна роздивлятись під мікроскопом через повітря або через масло (масляна імерсія). В останньому випадку на висушений фарбований препарат наноситься крапля кедрової олії і мікроби роздивляються з допомогою об’єктиву для масляної імерсії (з чорною смугою).

Результат:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Робота №5 Виявлення будови клітинної стінки мікроорганізмів. Класичний спосіб фарбування за Грамом та його модифікації.

Фарбування за Грамом – це один з найважливіших методів ідентифікації мікроорганізмів. Метод запропоновано Крістианом Грамом в 1884 році. Важливість данної методики для диференціації бактерій вперше було проголошено Емілем Ру в 1886 році. В наш час для фарбування мікроорганізмів багатьох морфологічних груп використовують і класичний варіант, і його різноманітні модифікації (табл. 7,8)

Диференціацію грампозитивних та грамнегативних бактерій можна проводити за допомогою КОН. В такому випадку на предметне скло з 2 краплями 3% КОН наносять мікробну культуру. Перемішують впродовж 5-10 секунд. Потім петлю опускають в краплю і піднімають вгору:

• грамнегативна: за петлею тягнеться тяж 0,5-2 см;

• грампозитивна: слизу не утворюють.

Принцип методу Грама:

• мікробну клітину зафарбовують основним аніліновим барвником фіолетового або – рідше – зеленого чи синього кольорів;

• проводиться обробка протравою, внаслідок чого утворюється потрійний комплекс барвник + протрава+ речовини клітини. Це з’єднання стійке у грампозитивних бактерій і нестійке – у грам негативних;

• короткочасна обробка препарату знебарвлювачем (спирт, ацетон, ксилол або їх суміші). Потім знебарвлюючу речовину видаляють з водою.

• препарат зафарбовують контрастним (червоним) барвником;

Табл. 7 Розчини для фарбування за Грамом.

Назва методу, модифікації	Спосіб фіксації	Розчини для фарбування *
		Кольорові розчини	Розчин для знебарвлення
Класичний метод Грама	Мазок фіксується жаром	Генціан фіолетовий (ГФ), розчин Люголя (РЛ), фуксин (Ф)	95%-ий етиловий спирт
Модифікація Синьова	-“-	Генціан фіолетовий на фільтрувальних папірцях (ГФ), розчин Люголя (РЛ), Фуксин (Ф)	95%-ий етиловий спирт
Модифікація Ніколля	-“-	Генціан фіолетовий (ГФ), розчин Люголя (РЛ), Фуксин (Ф)	Суміш ацетону та 95%-го етилового спирту
Модифікація Бьорка	-“-	Кристалічний фіолетовий (КФ), 1% Na2CO3, йодна протрава за Бурке, сафранін (С).	Суміш ацетону та 95%-го етилового спирту

Табл.8 Методики проведення фарбування за Грамом

№	Назва модифікації	Стадії фарбування*
1	Класичний метод Грама	ГФ (1-2 хв.); РЛ (1 хв); Змити Н2О; 3. Спирт (0,5 –1,0 хв); Змити Н2О; 4. Ф (1-2 хв.); Змити Н2О.
2	Модифікація Синьова	1. Папірці, накладені на мазок змочити водою (2хв); 2. РЛ (1 хв); Змити Н2О; 3. Спирт (0,5 хв); Змити Н2О; 4. Ф (1-2 хв.); Змити Н2О.

*Примітка. ГФ – генціанфіолетовий; КФ – кристалічний фіолетовий; РЛ- розчин Люголя, Ф– розведений карболовий фуксин Циля, С- сафранін.

Після здійснення фарбування грампозитивні мікроорганізми фарбуються у фіолетовий (у методі Калини – у чорно-фіолетовий або зелений), а грампозитивні – у червоний колір.