Фактори, що впливають на якість фарбування за Грамом

1. Бактеріальна плівка, нанесена на предметне скло, повинна бути тонкою (моношар клітин). Клітини або їх типові скупчення повинні бути розміщені в препараті на значній відстані.

2. Найкращі результати можна отримати, якщо проводити фарбування молодих культур (24-48 год). В особливих випадках одночасно готують препарати з культур різного віку: 6-8 годин, 12-24 години, 48 годин. Для запобігання можливим помилкам, фарбування невідомих мікробних культур треба проводити разом із відомими грампозитивними або грамнегативними мікроорганізмами (контроль).

3. На якість готових препаратів впливає методика підготовки препарату для фіксації. Суспензія мікроорганізмів повинна готуватись на дистильованій воді, а не на фізіологічному розчині. Фіксація повинна здійснюватись тільки на пальнику, але проводитись обережно (без тривалого прожарювання).

4. Фарбування повинно починатись тільки після охолодження препарату.

5. Наявність йодної кислоти (НJО₄), яка утворюється в розчині Люголя під дією світла і тепла, робить його непридатним для фарбування. Даний розчин потрібно зберігати в прохолодному місці, у флаконі з темного скла. При появі кислої реакції додавати Na₂СО₃.

6. Найкращім знебарвлювачем є ацетон або суміш ацетон+спирт.

Результат:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Робота №6 виявлення структур бактерій. Фарбування оболонок кислотостійких мікроорганізмів

Будова оболонок деяких мікробних клітин така, що вони погано взаємодіють з кислотами. До таких – кислотостійких – мікроорганізмів належать актиноміцети, мікобактерії та деякі бактерії, споріднені із ними, а також – бацилярні клітини з ендоспорами. Самим відомим методом для виявлення кислотостійких мікроорганізмів в патологічному матеріалі є метод фарбування Циля-Нільсена (табл.9.

Табл. 9 Реактиви для фарбування за методом Циля-Нільсена

Спосіб фіксації	Розчини для фарбування
	Кольорові розчини	Розчини для знебарвлення
Мазок з мокроти висушується на повітрі. Фіксується жаром	Карболфуксиновий барвник: 0,3 г фуксину розчиняють у 10 мл 95% етанолу, додають 5 мл фенолу, розчиненого у 95 мл дистильованої води. Метиленовий синій : 0,3 г солянокислої солі метиленового синього розчиняють у 100 мл дистильованої води.	5% сірчана кислота (Н2SО4) 97 мл 96% етилового спирту + 3мл концентрованої соляної кислоти (НС1)

Послідовність фарбування мазка для виявлення кислотостійких мікроорганізмів представлена на схемі.

1	На фіксований препарат наносять карболфуксиновий барвник (фуксин Циля). Нагрівають на пальнику (без кипіння!). На мазок також можна накладати папірець, просочений барвником. В такому випадку мазок змочують Н2О. Результат: Всі клітини препарату фарбуються в червоний колір
2	Охолоджують, промивають слабким струменем води
3	Плівку поміщають в знебарвлюючий розчин, промивають водою. 1.Операції повторюють до тих пір, поки плівка не буде блідо-рожевого кольору або жовтуватого кольору При використанні сірчаної кислоти як знебарвлювачапрепарат прополоскують спиртом Результат: Нестійки до кислот мікроби при взаємодії з розчином НС1 або Н2SО4 знебарвлюються
4	Дофарбовують мазок 2-3 хв в розчині метиленового синього за Лефлером. Промивають водою. Підсушуюють фільтрувальним папером. Результат: Додатковий барвник фарбує знебарвлені клітини в синій колір. При мікроскопії – кислотостійки бактерії – червоні, всі інші – сині.

Рис. Стадії роботи при проведенні фарбування за Цилем-Нільсеном