А) Получение вытяжки рибофлавина

Навеску материала (печень, проростки, дрожжи) (5 г) растирают в ступке с кварцевым песком и 10 мл 0,1 н раствора серной кислоты, переносят в мерную колбу на 100 мл, доводят объем содержимого кислотой до 75 мл и на кипящей водяной бане нагревают при помешивании в течение 45 мин. Затем колбу охлаждают, добавляют 5 мл ферментного препарата, выдерживают при 45°С в те­чение 40 мин, доводят объем до 100 мл и фильтруют.

Б) Определение содержание рибофлавина в вытяжках

В две градуированные пробирки вливают по 8 мл фильт­рата. В одну пробирку добавляют 0,5 мл образцового раство­ра, содержащего 0,25 мкг рибофлавина. В обе пробирки при­ливают по каплям 4% раствор перманганата калия до появления слабо-розового окрашивания (примерно 1 мл). Через 10 мин удаляют избыток перманганата 3% раствором Н₂О₂, до­бавляя его по каплям (пока раствор полностью не обесцветится). Объем полученных растворов доводят водой до 10 мл и измеряют интенсивность флуоресценции. По окончании флуорометрии в обе пробирки вносят по 0,2 мл раствора хлорида олова (II) SnCl₂ и 0,1 мл раствора Na₂S₂O₄·2H₂O для тушения флуоресценции витамина В₂ и измеряют флуоресценцию при­месей.

Содержание рибофлавина в мкг на 1 г исследуемого материала определяют по формуле:

,

где А – показание флуорометра для опытного раствора;

В – показание флуорометра для опытного раствора после туше­ния флуоресценции рибофлавина;

A₁ – показание флуоромет­ра для образцового раствора рибофлавина;

b₁ – показание флуорометра для образцового раствора рибофлавина после тушения флуоресценции;

0,5 – количество микрограммов ри­бофлавина в 1 мл образцового раствора;

V – объем экстрак­та перед измерением флуоресценции (10 мл);

V₁ – объем вы­тяжки, взятой для анализа, мл;

V₂ – объем всей вытяжки, мл;

n — навеска материала, г.

Лабораторная работа № 3 Определение времени темновой адаптации (физиологический тест)

Повышение световой чувствительности зрительного анализатора в условиях малой освещенности в значительной степени зависит от скорости регенерации зрительного пурпура, протекающей с участием витаминов А и В₂. При недостаточном обеспечении организма ретинолом и рибофлавином продолжительность темновой адаптации возрастает вплоть до потери способности видеть при сумеречном освещении.

Установлено, что максимум световой чувствительности глаза при ярком освещении находится в желто-зеленой части спектра, а при низкой освещенности смещается в зеленую область. Поэтому при одинаковой низкой освещенности, когда цвета неразличимы, поверхности, окрашенные в сине-зеленые тона, воспринимаются как более светлые, чем поверхности синего и красного цветов. На этом явлении смещения максимума световой чувствительности (феномен Пуркинье) основаны методы определения темновой адаптации.

Ориентировочно определение времени темновой адаптации можно провести упрощенным способом с помощью таблиц Кравкова - Пуркинье (плотный картон 20 х 20 см оклеен черной бумагой; отступя 4 см от края, наклеены по углам цветные квадраты (3 х 3 см) из голубой, желтой, красной и зеленой бумаги). В затемненной комнате таблицу размещают на уровне глаз обследуемого на расстоянии 40-50 см.

При нормальной функции темновой адаптации обследуемый через 40-50 секунд отмечает появление светлого квадрата на месте желтого, затем светло-серого на месте голубого квадрата. Красный и зеленый квадраты в этих условиях не видимы.

При пониженном светоощущении на месте желтого квадрата может появиться светлое пятно, голубой же квадрат останется неразличим.

Вращая таблицу, проверяют правильность ответов испытуемых. Для удобства контроля на противоположной стороне таблицы на месте проекции желтого и голубого квадратов наклеивают соответственно одно или два утолщения из картона, легко прощупываемых обследователем в темноте.