Б) Определение каротинов

Хроматографическую бумагу нарезают на полоски длиной 25 см и шириной 15 см. 0,5-1 мл ацетонового (или спиртового) раствора пиг­ментов наносят (в виде полосы) на полоску хроматографической бумаги на расстоянии 4 см от ее нижнего края. Бумагу подсушивают на воздухе (лучше всего с помощью фена) в затененном месте и затем сворачивают в однослойную трубку, верхний конец которой сшивают или скрепляют пластмассовой скрепкой. Трубку ставят на дно стеклянного сосуда, куда заранее был налит петролейный эфир или низкокипящий бензин слоем в 2-3 см (он дол­жен быть ниже места нанесения раствора пигментов на бумагу). Через 20-30 мин. бумажную трубку вынимают из сосуда. Вырезают полоску бумаги, окрашенную в жел­то-оранжевый цвет (она находится сразу же за фронтом подъема растворителя), измельчают ее (нарезают) в стеклянный бюкс или стаканчик и извлекают каротины небольшими порциями (по 1-2 мл) петролейного эфира или бензина, повторяя экстрагирование до получения бесцветного раствора. Раствор каротинов доводят этими же растворителями до определенного объема (например, 10-20 мл) и колориметрируют, употребляя в качестве стандартного рабочий раствор азобензола (14,5 мг в 100 мл). Содержание каротина (в миллиграммах на 100 г продукта) Х рассчитывают по формуле:

где V₁ — объем ацетонового (спиртового) экстракта пигментов в мерном цилиндре, мл;

V₂ — объем ацетоно­вого (спиртового) экстракта, нанесенный на бума­гу, мл;

V₃ — объем раствора каротинов в петролейном эфире или бензине, взятый для колориметрирования, мл;

D₁ — показания шкалы колориметра для стан­дартного раствора;

D₂ — показания шкалы колориметра для исследуемого раствора (среднее из 3-4 определе­ний);

n — навеска растительного материала, г.

При колориметрировании каротинов пользуются си­ним светофильтром.

Лабораторная работа № 3 Спектрофотометрический метод определения содер­жания ретинола в рыбьем жире

Материалы, посуда, реактивы:

рыбий жир (медицинский);

едкое кали, 50% водный раствор;

этиловый спирт, 95%, не содержащий альдегидов. Для проверки на альдегиды к 10 мл спирта добавляют 10 мл воды, 1 мл 2 % раствора азотнокислого сереб­ра и (по каплям) раствор аммиака до исчезновения обра­зующегося вначале осадка; смесь ставят в темное место на 12 часов; она должна оставаться бесцветной и про­зрачной;

этиловый спирт абсолютный, 99,8% (по объему). Для получения его к 95% спирту-ректифи­кату прибавляют негашеную известь в таком количестве, чтобы куски ее выступали над поверхностью жидкости в колбе. Соединяют колбу с обратным холодильником, снабженным хлоркальциевой трубкой с негашеной из­вестью, осторожно нагревают на водяной бане (при тем­пературе не выше 75° С) в течение часа и затем остав­ляют стоять на два дня. Через два дня отгоняют спирт в колбу Бунзена, которую плотно соединяют с холодиль­ником. Отводную трубку колбы соединяют с хлоркаль­циевой трубкой. Концентрация такого спирта составляет около 99,5%. Для более полного удаления влаги к 99,5% спирту добавляют твердый едкий натр или едкое кали (10 г на 1 л) и перегоняют, отбрасывая начальную и конечную фракции;

диэтиловый эфир;

сернокислый натрий, прокаленный, сохраняют в сосу­де с притертой пробкой;

спект­рофотометр;

делительные воронки;

колбы конические емкостью 100 мл;

колбы для от­гонки;

баня водяная;

баллон с азотом.

Ход работы:

В конической колбе емкостью 100 мл отвешивают на аналитических весах около 1 г жира, прибавляют 30 мл этилового спирта, не содержащего альдегидов, и 3 мл 50% раствора едкого кали. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и ставят на 30 мин. в горячую водяную баню (85-90° С). После омыления колбу ох­лаждают, добавляют 50 мл воды и содержимое переносят в делительную воронку. Неомыляемую фракцию три раза экстрагируют диэтиловым эфиром, при этом первый раз берут 50 мл его, а во второй и третий – по 30 мл. Все эфирные вытяжки сливают в другую делительную ворон­ку и несколько раз промывают водой до полного удале­ния остатков щелочи (проба с фенолфталеином). Для обезвоживания к промытой эфирной вытяжке добавляют 8 г прокаленного сернокислого натра и ставят на 30 мин. в темное место, время от времени встряхивая, после чего фильтруют через сухой бумажный фильтр в колбу для перегонки. Сернокислый натрий на фильтре несколько раз промывают диэтиловым эфиром (берут каждый раз по 10 мл), который фильтруют в ту же колбу. Эфир от­гоняют на водяной бане при температуре до 40° С (если отгонку ведут в токе азота, температуру бани можно по­высить до 47-50° С).

Примечание. Отгонку эфира рекомендуется вести в токе азота, учитывая легкую окисляемость ретинола; в студенческой работе, рассчитанной на ознакомление с методом, отгонку допускается проводить на воздухе (под тягой!), соблюдая противопожарные ме­роприятия.

После отгонки эфира неомыляемый остаток раство­ряют в абсолютном этиловом спирте до получения рас­твора, содержащего в 1 мл 8 международных единиц (ME) витамина А (при изготовлении раствора учитыва­ют, что в 1 г невитаминизированного рыбьего жира дол­жно содержаться не менее 350 ME витамина А; в 1 г ви­таминизированного рыбьего жира содержится 1000 ME ретинола). Изменяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длинах волн 311, 324,5 и 334 нм.

Содержание витамина А в международных единицах х в 1 г жира вычисляют по формуле:

,

где D _испр = 7 D _324,5 – 2,912 D ₃₁₁ – 4,088 D ₃₃₄ ;

D_324,5, D₃₁₁, D₃₃₄ – оптические плотности раствора при длинах волн 324,5, 311 и 334 нм соответственно;

V — разведе­ние, мл;

Q — навеска жира, г;

1850 — коэффициент пере­вода в международные единицы.

Одна международная единица витамина А равна 0,3 мкг.