3.5. Методи кількісного визначення ферментів

Методи виділення та визначення активності ферментів. Одиниці ферментативної активності. Молекулярна та питома активність ферментів. Перерахунок на загальну кількість білка в пробі (гомогенаті). Фактори, що впливають на ферментативну активність: концентрація субстрату, активатори, інгібітори, склад буферу, температура. Методи визначення ферментативної активності. Метод Луорі для визначення концентрації сумарного вмісту білка у пробі. Побудова калібрувальних кривих. Не спряжені (неперервні) та спряжені методи дослідження активності ферментів.

4. Ферменти, що використовуються в генній інженерії

4.1. Властивості нуклеаз та способи їх використання в генній інженерії

Явище модифікації-рестрикції. Системи модифікації-рестикції, їх номенклатура та генетичний контроль. Роль систем рестрикції і модифікації ДНК, що індукуються клітиною-хазяїном. Метилювання ДНК фагів і бактерій.

Ферменти рестрикції і модифікації. Специфічність і механизм дії рестриктаз та метилаз. Антирестриктазні механізми бактеріофагів. Ферментний інструментарій. Ферменти, що використовуються в молекулярно-генетичному дослідженні. Системи модифікації-рестрикції класу І. Ендонуклеази рестрикції класу І та ІІІ. Ендонуклеази рестрикції класу ІІ. Характеристика сайтів впізнавання цих ферментів. Ізошизомери. Розщеплення молекул ДНК за допомогою ендонуклеаз рестрикції класу ІІ. Умови розщеплення.

Основні способи використання ендонуклеаз рестрикції класу ІІ в генетичній інженерії. Принципи фізичного картування геномів. Методи побудови рестрикційних карт. Отримання та аналіз макрофрагментів ДНК. Побудова РFGE-карт хромосом.

Використання ендонуклеаз рестрикції для отримання та аналізу геномних фінгерпринтів, виявлення перебудов геному та точкових мутацій, підрахунку числа копій генів, вивчення білок-нуклеїнових взаємодій та генетичного поліморфізму. Поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів та його використання.

Вплив метилування на розщеплення ДНК ендонуклеазами рестрикції. Виявлення сайтів метилування ДНК. ДНК-метилази, їх використання для одержання великих рестрикційних фрагментів ДНК. ДНК-лігази. Механізм лігірування ДНК Т4-ДНК-лігазою.

2. Властивості днк-полімераз та способи їх використання в генній інженерії

Загальна характеристика ДНК-полімераз, які використовуються в генній інженерії. Типи нуклеазної активності: 5’- 3’- полімеразна, 5’- 3’- екзонуклеазна, 3’- 5’ – екзонуклеазна, їх використання в генно-інженерних роботах. Будова та властивості ДНК-полімерази І та її Кленов-фрагмента, ДНК-полімераз фагів Т4 і Т7, термінальної дезоксинуклеотидил-трансферази. Умови синтезу ланцюгів ДНК іn vitro за допомогою ДНК-полімераз. Процесивність ДНК-полімераз.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Будова сучасного ампліфікатора. Компоненти реакційної суміші, необхідні для проведення ПЛР. Властивості Taq-ДНК-полімерази. Фактори, що впливають на точність синтезу ДНК та можливості її підвищення. Специфічність та ефективність ПЛР. Стандартні умови та критичні параметри проведення ПЛР. Цикли ПЛР. Джерела ДНК для ПЛР. Варіанти ПЛР (RT-ПЛР, ПЛР-in situ, асиметрична ПЛР та ін..) та їхні можливості. Ампліфікація довгих фрагментів ДНК. Методи підвищення точності ампліфікації. Имуно-ПЛР. Випадкова ампліфікація поліморфних послідовностей (метод RAPD). ПЛР in situ. Емульсійна ПЛР. Принцип дії зондів: Taq-Man, зондів, основаних на FRET, «молекулярних маяків», праймерів типу «Скорпіон».

Використання ПЛР для клонування та конструювання генів, вивчення їх експресії, секвенування ДНК, детекції мутацій, виявлення патогенів, пренатальної діагностики статі, діагностики раку та інших спадкових захворювань, пошуку специфічно людських ДНК, вивчення зчеплення генів, внутрівидового генетичного поліморфізму і таксономічних досліджень.

Проблема кількісного визначення вмісту матричних полінуклеотидів в ампліфікованих зразках. ПЛР у реальному часі. Одержання точкових мутацій, делецій і вставок за допомогою ПЛР.

ДНК-залежна ДНК-полимераза I Е.со1i, її використання для введення кінцевої радіоактивної мітки, «затуплення» кінців ДНК та ник-трансляції. Термостабільні ДНК-залежні ДНК- полімерази.

Будова, властивості РНК-залежних ДНК-полімераз (зворотніх транскриптаз) ретровірусів, їх використання для одержання кДНК.

Характеристика ферментів, що використовуються при конструюванні рекомбінантних ДНК: ферменти, за допомогою яких одержують фрагменти ДНК; ферменти, що синтезують ДНК на матриці ДНК або РНК; ферменти, що з’єднують фрагменти ДНК; ферменти, які дозволяють здійснити зміну структури кінців фрагментів ДНК.