5.4. Секвенування нуклеїнових кислот

Секвенування (визначення нуклеотидної послідовності) молекул нуклеїнових кислот. Загальні підходи до визначення первинної структури біополімерів. Роботи Ф.Сенджера. Використання методів фракціонування нуклеїнових кислот в поліакриламідних гелях під час секвенування нуклеїнових кислот.

Методи визначення нуклеотидної послідовності РНК. Характеристика РНКаз, що використовуються при секвенуванні РНК. Специфічне розщеплення РНК на великі фрагменти. Метод часткового розщеплення РНК-азами термінально мічених РНК. Метод формамідного гідролізу з ідентифікацією новоутворених 5' - кінцевих ділянок. Метод специфічного хімічного розщеплення РНК. Непряме секвенування РНК через синтез кДНК.

Методи визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Метод секвенування ДНК за допомогою специфічного хімічного розщеплення ( метод Максама і Гілберта). Отримання субстратів для цього методу. Характеристика реакцій, які використовуються для специфічної фрагментації ДНК.

Секвенування ДНК методом полімеразного копіювання Сенджера (метод термінуючих аналогів нуклеотидів). Характеристика векторів для секвенування ДНК.

Гібридизація як метод виявлення специфічних послідовностей нуклеотидів. Гібридизація за Саузерном. Концепція STS-маркерів. Комп’ютерний аналіз нуклеотидних послідовностей. Електронна ПЛР.

Підготовка матриць для полімеразного копіювання. Переваги і недоліки вказаних методів. Альтернативні техніки секвенування (використання скануючої тунельної мікроскопії, секвенування за допомогою молекулярної гібридизації).

Стратегії секвенування всього генома окремих організмів. Секвенування кДНК. Етапи секвенування великих ділянок ДНК.

Принцип автоматичного секвенування ДНК. Аналіз даних секвенування. Бази даних секвенованої ДНК. Приклади секвенування ДНК окремих хромосом та геномів. Геноміка, транскриптоміка, протеоміка.

6. Клонування генів. Створення бібліотек генів. Векторні системи

Клонування як один з методів виділення та ідентифікації фрагментів ДНК, а також одержання їх у необмеженій кількості. Використання виділених та ідентифікованих фрагментів у молекулярному аналізі, в якості ДНК-зондів, для створення бібліотек генів.

6.1. Методи клонування днк

Клонування фрагментів ДНК за сайтами рестрикції, а також з використанням адаптерів, лінкерів та коннекторів.

Бібліотеки та клонотеки кДНК, генів та нуклеотидних послідовностей. Клонотеки генів. Способи їх одержання. Поняття про репрезентативність

клонотеки. Клонотеки геномної ДНК та кДНК. Пошук послідовностей нуклеотидів у клонотеках генів. Використання мічених зондів: гомологичні та гетерологічні зонди. Одержання бібліотек EST-послідовностей. Методи скринінгу бібліотек та клонотек ДНК. Гібридизація із зондами. Використання ПЦР. Використання антитіл та функціональні тести.

Зворотня трансляція. Використання антитіл для добору клонів в експресованих клонотеках. Клонування in silico.

Позиційне клонування.

6.2. Векторні молекули днк

Конструювання та використання векторів для клонування генів у клітинах дріжджів, ссавців і людини. Методи та механізми трансформації клітин рекомбінантними ДНК. Знаходження трансгенних клітин.

Поняття про вектор. Вимоги до векторних молекул. Типи векторів, їх конструювання. Вектор та його ємкість. Полілінкер. Функціональна класифікація векторів: экспресуючі вектори, човникові (бінарні) вектори. Властивості бактеріальних плазмід, що використовуються при конструюванні векторних молекул: здатність до автономної реплікації, контроль кількості копій, консервативність разміру, групи сумісності.

Маркерні гени, які використовують в векторах загального призначення. Підходи до конструювання векторів ( зменшення розміру молекул, введення та видалення сайтів розщеплення рестриктазами, включення селективних маркерних генів).

Плазміди серії pBR як основа конструювання плазмідних векторів.

Плазмідні вектори загального призначення для E.coli та інших бактерій. Плазмідні вектори для прямого добору, для клонування промоторів та термінаторів, клонування кДНК.

Вектори для секвенування ДНК. Фагмідні вектори, їх констрування та використання. Будова фагміди pBluscriptII SK+.

Вектори для прямого клонування продуктів ПЛР.

Вектори на основі хромосоми фага λ. Інсерційні вектори та вектори із заміщенням. Способи упаковки рекомбінантної ДНК у фагові частки. Косміди та фазміди, їх будова та особливості використання. Принципи конструювання і селекції рекомбінантних ДНК на основі космід.

Ретровірусні та аденовірусні вектори, вектори на основі хромосом аденоасоційованих вірусів. Принципи адресної доставки трансгенів. Керування експресією трансгенів у клітинах-мишенях. Переваги і недоліки фагових векторів.

Ефективність трансфекції рекомбінантними ДНК. Системи пакування рекомбінантних ДНК in vitro.

Вектори на основі ниткоподібних фагів (M13,f1,fd). Будова геному і особливості життєвого циклу ниткоподібних фагів. Принципи конструювання та використання векторів на основі ниткоподібних фагів.

Фактори, що впливають на ефективність експресії рекомбінантних генів у

бактеріальних клітинах: транскрипція, трансляція, стабільність рекомбінантних РНК і білків, тільця включення.

Конструювання, будова і використання дріжджових штучних хромосом (YAC). Векторні системи на основі фага Р1 (PAC). Бактерійні штучні хромосоми (BAC). Штучні хромосоми ссавців (MAC) та людини (HAEC).