5. Методи аналізу нуклеїнових кислот

5.1. Виділення та очистка препаратів днк та рнк

Приготування зразків тваринних та рослинних тканин, культур мікроорганізмів для виділення нуклеїнових кислот. Методи виділення тотальної ДНК. Етапи виділення ДНК.

Особливості виділення плазмідної та вірусної ДНК. Способи депротеїнізації нуклеїнових кислот. Виділення РНК з препаратів ДНК. Приготування препаратів РНК з бактеріальних клітин. Виділення polyA- РНК.

Синтез ДНК та рестрикція. ДНК-полімерази та рестриктази. Класи рестриктаз: часто- (4-5 п.о.), середньо-(6-8 п.о.) та рідкорозщеплюючі (8-12 п.о.). Використання сайтів рестрикції в якості генетичних маркерів ДНК. Фізичне картування ДНК. Поняття про шмер.

5.2. Синтез генів in vitro

Хімічний синтез олігодезоксирибонуклеотидів. Захист функціональних груп нуклеозидів та нуклеотидів у реакціях хімічного синтезу олігонуклеотидів. Методи хімічного синтезу олігонуклеотидів: фосфатдиефірний, фосфаттриефірний, фосфіттриефірний. Принцип блочного синтезу. Твердо- фазний синтез олігонуклеотидів та його автоматизація.

Етапи синтезу дволанцюгових фрагментів ДНК in vitro. Властивості ДНК-лігаз. Синтез Х.Кораною генів т-РНК. Синтез К.Ітакурою генів інсуліну, соматотропину. Хімічний синтез лінкерів, адаптерів, регуляторних ділянок, ДНК-зондів, праймерів, нонсенс-кодонів.

Ферментативний синтез генів. Властивості та особливості використання полінуклеотидфосфорилаз. Синтез к-ДНК за участю зворотної транскриптази (ревертази). Етапи синтезу к-ДНК. Праймери для зворотної транскрипції. Методи виділення індивідуальних к-ДНК.

Комбінування хімічного та ферментативного синтезу полінуклеотидів. Монтування генів.

5.3. Молекулярна гібридизація нуклеїнових кислот

Особливості мічення ДНК-олігонуклеотидів. Поняття про ДНК-зонд. Включення міток у молекули ДНК і РНК in vitro. Характеристика радіоактивних (32Р, 33Р, 35S, 3Н) та нерадіоактивних (біотинова, диоксигенінова, флюоресцентна) міток нуклеїнових кислот та способи їхньої детекції. Вимоги до матриць, що використовуються у реакціях мічення.

Включення міток у ДНК за допомогою методу нік-трансляції та методу випадкових гексануклеотидних праймерів. Мічення 3’-кінців ДНК за допомогою ДНК-полімераз та термінальної трансферази. Дефосфорилювання ДНК лужною фосфатазою. Включення 5’- кінцевої мітки за допомогою полінуклеотидкінази.

Використання ПЛР для мічення ДНК. Мічення ДНК за допомогою транскрипції in vitro. Мічення к-ДНК за допомогою зворотної транскрипції.

Гібридизація нуклеїнових кислот in situ. Блот-гібридизація нуклеїнових кислот. Поняття про блоттинг. Електроблотинг. Фіксація нуклеїнових кислот на фільтрах. Методи гібридизації нуклеїнових кислот: гібридизація за Саузерном, Нозерн-блоттинг, Вестерн-блоттинг, дот- та слот- гібридизація (етапи проведення та розрішальна здатність). Гібридизація з використанням колоній, утворених мікроорганізмами та бляшок, утворених вірусами. Методи детекції та оцінки гібридизаційних сигналів. Хемілюмінесцентна та колориметрична детекція гібридизації. Аналіз результатів ДНК-РНК та ДНК-ДНК –гібридизації.

Напрямки використання методів гібридизації нуклеїнових кислот (ідентифікація генів та вивчення їх експресії, діагностика спадкових захворювань та інфекційних агентів, визначення спадкового поліморфізму, проведення таксономічних досліджень та геномної дактилоскопії тощо).

Створення і використання ДНК-мікрочіпів.

Основні недоліки метода блот-гібридизації.