Методы микробиологической диагностики ботулизма

А. Бактериологический (по классической схеме с последующей

биологической пробой – см. ниже).

Методы микробиологической диагностики газовой гангрены Бактериологический

Исследование проб на наличие патогенных клостридий.

Исследуемый материал.

Посев на среды:				Посев по 1 мл в жидкие питательные среды - мясные или казеиновые (5 пробирок): 1-я пробирка - непрогретая, 2-я - прогрев при 80°C - 15 минут, 3-я - прогрев при 100ºC - 5 минут, 4-я - прогрев при 100ºC - 10 минут, 5-я - прогрев при 100ºC - 20 минут. Инкубация при 37ºC 1-15 суток.
в чашках		в пробирке
Кровяной МПА	Среда Виллиса-Хоббс		Среда Вильсон-Блера
Анаэробные условия
Инкубация при 37ºС 1-7 суток
Микроскопия, изоляция и пересев на мясную или казеиновую среду колоний, вызывающих гемолиз, опалесценцию или почернение на одной из указанных выше сред и состоящих из грамположительных палочек.				Выросшие культуры, содержащие массу грамположительных палочек, подвергают дальнейшему изучению.
Изучение свойств выделенных культур.				Проверка токсичности фильтратов или центрифугатов на мышах или морских свинках.	Посев на плотные питательные среды: чашки с кровяным МПА, со средой Виллиса-Хоббс, с бензидиновым МПА, столбик агара Вильсон-Блера.
				Реакция нейтрализации с сыворотками: C. perfringens типа А, С. novyi типа А, В, C. septicum, C. sordellii, C.histolyticum.	Инкубация при 37°C 1-4 суток. Изоляция колоний, вызывающих гемолиз, опалесценцию или почернение на питательных средах. Изучение свойств выделенных культур.

Б. Биологический Для обнаружения токсина и его типа в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсина двум мышам вводят исследуемый фильтрат в количестве 0,5 мл внутрибрюшинно, другим двум мышам вводят смесь, состоящую из 0,5 мл фильтрата и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типа А, В, С, Е (соединяют по 0,5 мл сыворотки каждого типа). Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Наблюдение за животными ведут в течение 4 дней. При наличии токсина погибают первые две мыши, остальные остаются живы.

При обнаружении токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина. Для этого в 5 пробирок разливают по 2,4 мл испытуемого фильтрата и в каждую пробирку прибавляют по 0,6 мл сыворотки раздельно типа А, типа B, типа С и типа Е. В 5-ю пробирку прибавляют 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутрибрюшинно по 1 мл 2 мышам из каждой пробирки отдельными шприцами. Наблюдают за животными в течение 4 дней. При наличии токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, остальные мыши гибнут. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.