Особенности организации генома

ДНК провируса (ВИЧ-1) состоит из 9283 нуклеотидных пар (н.п.) и фланкирована LTR из 638 н.п.

В составе генома (ДНК-провируса) девять генов, которые контро­лируют синтез 9 структурных и 6 регуляторных белков:

gag - p17, р24, р7, р6 - эти белки образуют сердцевину вириона;

роl - р10 (протеаза), p66/р51- ревертаза (обратная транскриптаза, РНК-аза Н, ДНК-зависимая ДНК-полимераза), р31 (интеграза, или эндонуклеаза);

env - гликопротеиды оболочки (gp120, gp41).

Указанные девять белков входят в состав вириона.

Регуляторные гены и белки

tat – p14 (TAT); vif – р23 (VIF);

rev – p12 (REV); vpu – p16 (VPU);

nef – p27 (NEF); vpr – - (VPR).

Таким образом, девять генов вируса кодируют синтез 15 белков. Это связано с тем, что некоторые гены имеют экзонно-интронную структуру и имеют несколько рамок считывания.

Схематическое расположение генов вируса можно изобразить следующим образом:

5`-LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-3`-LTR

Сложность работы генома вируса связана с наличием в LTR спе­циальных регуляторных элементов:

а) сигнал транскрипции (область промотора);

б) сигнал добавления поли-А;

в) сигнал копирования;

г) сигнал интеграции;

д) элемент позитивной регуляции (TAR для белка ТАТ);

е) элемент негативной регуляции (NRE для белка NEF);

ж) участок прикрепления затравочной РНК (тРНК^лиз) для синтеза минус-цепи ДНК на 3’-конце; сигнал на 5’-конце LTR, который служит затравкой для синтеза плюс-цепи ДНК.

3. Взаимодействие вируса с клеткой протекает по следующей схеме: адсорбция вируса на клетке, имеющей рецептор CD4 - окаймленная ямка - окаймленный пузырек - лизосома - слияние мембран - выход нуклеокапсида в цитоплазму - син­тез обратной транскриптазой минус-цепи ДНК - разрушение РНК-азой Н вирионной РНК - синтез ДНК-полимеразой плюс-цепи ДНК - образование LTR - проникновение ДНК-провируса в ядро (в хромосому с помощью интегразы). Активация вируса - синтез полноразмерных и субгеномных РНК клеточной РНК-полимеразой - протеолиз и процессинг env-белков - синтез других белков - ассоциация двух молекул геномной РНК с капсидными белками - включение двух молекул РНК (а также двух молекул затравочной тРНК и pol- белков) в капсид - мембрана клетки - липидная оболочка - белки gp4I и gpI20 - отпочкование вирионов - образо­вание симпластов из Т-лимфоцитов - их гибель. Далее развивается иммунодефицит - нарушение других систем - присоединение оппортунистических инфекций.

Заражение вирусом - начало вирусоносительства. Активация Т-лимфоцита (и, соответственно, вируса) каким-либо антигеном - начало болезни.

4. Вирусологический диагноз ВИЧ-инфекции трудно осуществим, так как животные к вирусу не чувствительны, а вирус размножается только в одном клоне лимфоцитов (Н9), которых лаборатории не имеют. Наличие вируса или его антигенов можно обнаружить с помощью некоторых иммунологических реакций, но для этого требуются специфические антитела, получение которых связано с большими трудностями. Широко используется ПЦР.

5. а) Основным скрининговым методом диагностики ВИЧ-инфекции и особенно выявления вирусоносительства является использование иммуноферментного анализа. Имеющиеся коммерческие тест-системы просты в употреблении, содержат сенсибилизированные антигеном лунки в планшетах, все необходимые ингредиенты и контроли. В силу своей универсальности этот метод получил повсеместное применение. Демонстрация отечественных тест-систем для иммуноферментного определения антител к вирусу иммунодефицита человека. Постановка реакции (методика описана в занятии 17).

Недостатком иммуноферментного метода является то, что нередко он дает ложнопозитивные результаты. Поэтому в случае сомнения такая сыворотка подвергается контрольному испытанию более чувствительными специфичными методами, например с помощью метода иммуноблотинга или иммунопреципитации.

б) Метод иммуноблотинга представляет собой тестирование твердо-фазным иммунологическим анализом электрофоретически разделенных белков. Реакция ставится в следующей последовательности: электрофоретическое разделение анализируемого материала на индивидуальные белки или полипептиды в геле; получение реплики путем переноса исследуемых белков с геля на твердофазный матрикс; блокирование незанятых центров связывания белков матрикса; инкубирование со специфической тест-сывороткой; отмывка от избытка сыворотки; инкубирование с меченым иммунореагентом на антитела специфической сыворотки; отмывка от избытка меченого иммунореагента; выявление тестируемых белков или полипептидов с помощью метки иммунореагента.

Для разделения анализируемого материала используют чаще всего различные варианты электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ).

После электрофоретического разделения белков их иммобилизуют на твердой фазе (матриксе), в качестве которой в основном применяют нитроцеллюлозные мембраны (НЦМ). На ПААГ помещают НЦМ и проводят электрофоретический перенос в перпендикулярном к гелю направлении.

На полученной нитроцеллюлозной реплике блокируют активные центры связывания во избежание неспецифической адсорбции реагентов. С этой целью НЦМ инкубируют с раствором бычьего сывороточного альбумина в концентрации 2-5% в течение 1-2 часов.

После блокирования активных мест связывания НЦМ инкубируют с эмпирически подобранным разведением специфической сыворотки (т.е. заведомо положительной сывороткой), причем время инкубирования изменяется в широком диапазоне в зависимости от авидности компонентов. Обычно инкубирование в течение двух часов при 37°C или в течение ночи при 4°C дает хорошие результаты. НЦМ несколько раз отмывают блокирующим раствором от неспецифически адсорбированной сыворотки и тестируют специфические антитела одним из методов твердофазного иммунного анализа, чаще всего используют ИФМ или РИМ. В том и другом случае НЦМ после обработки специфической сывороткой инкубируют с меченными ферментом антивидовыми антителами, в качестве метки используют пероксидазу хрена (ИФМ) либо радиоактивный йод (РИМ).

После отмывки физиологическим буфером избытка меченых антител на заключительном этапе проведения иммуноблотинга выявляют тестируемые антитела по ферментативной реакции с соответствующим субстратом или авторадиографическим методом.

Приложение к ЗАНЯТИЮ 15