Клещевого энцефалита

План занятия:

А. Микробиологический диагноз энтеровирусных инфекций

1. Вирусологический диагноз полиомиелита. Заражение вирусосодержащим материалом культуры клеток эпителия почки обезьяны.

а) регистрация роста вируса полиомиелита в клетках культуры ткани, цитопатический эффект;

б) цветная реакция.

2. Серологический метод диагностики полиомиелита:

а) обнаружение типа и титра антител к вирусу полиомиелита методом цветной пробы (демонстрация);

б) обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации (разбор).

Б. Микробиологический диагноз ротавирусных инфекций. Разбор схемы.

В. Микробиологический диагноз калицивирусных и норовирусных инфекций. Разбор схемы.

Г. Микробиологический диагноз клещевого весенне-летнего энцефалита. Разбор схем диагностики.

Д. Микробиологический диагноз бешенства. Разбор схемы исследования.

Методические указания

А. Микробиологический диагноз энтеровирусных инфекций

1. Вирусологический диагноз полиомиелита. Материалом для диагностики полиомиелита слу­жат испражнения больного, готовят 10%-ную взвесь испражнений в растворе Хэнкса, центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатывают ан­тибиотиками (1000 ед, пенициллина и 1000 ед. стрептомицина на 1 мл). Подготовленный таким образом материал смешивают со свежей питатель­ной средой. Выросшую однослойную культуру ткани просматривают под микроскопом и отбирают пригодную для заражения. Стерильной пастеров­ской пипеткой отсасывают питательную среду. В культуру ткани вносят 1 мл материала в свежей питательной среде и пробирку ставят в гори­зонтальном штативе в термостат.

О наличии и размножении вируса полиомиелита в клетках культуры тканей узнают по цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки ткани гибнут и под микроскопом обнаружи­ваются дегенеративные изменения. Клетки образуют симпласты, часто округляются и отторгаются пластами от стенок пробирки. В культуре ткани, не зараженной вирусами, под влиянием продуктов метаболизма клеток рН среды изменяется в кислую сторону, и цвет индикатора ме­няется на желтый. Если в исследуемом материале имеется вирус полио­миелита, то клетки гибнут, рН среды меняется незначительно - среда сохраняет розовый цвет.

2. Серологический диагноз полиомиелита. Определение антител и их, титра к вирусу полиомиели­та производят с помощью метода цветной пробы. Сыворотку больного полиомиелитом разводят в пробирках от 1:4 до 1:64 в объеме 0,25 мл. В каждую пробирку добавляют по 0,25 мл вируса полиомиелита и по 0,4 мл вазелинового масла. Через 40-60 минут в пробирки вносят по 0,25 мл клеточной суспензии, содержащей 100000 живых клеток в 1 мл. После инкубирования пробирок в термостате в течение 3-7 дней учитывают результат. Пожелтение среда в пробирках указывает на нейтрализацию вируса антителами и рост культуры клеток. Наибольшее разведение сы­воротки, нейтрализующее вирус, является титром сыворотки.

Обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации

Реакция преципитации в агаре широко используется для диагнос­тики вирусных заболеваний (полиомиелита, коксаки и др.) Реакция может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах.

Постановка реакции преципитации на предметных стеклах. На обычные предметные стекла наносят 2 мл расплавленного и охлаждённого до 60°C агара (1%-ный агар на физиологическом растворе с 1:20000 мертиолята). Толщина слоя агара на стекле составляет около I мм. После застывания агара в нем вырезают лунки диаметром 3-4 мм с расстоянием между центрами луночек 5-6 мм. Количество луночек и их расположение на стекле могут быть различными в зависимости от условий опыта. Объем исполь­зуемых ингредиентов 0,02 мл. Реакция ставится с несколькими контролями. Для определения антигена вируса вырезают 4 лунки (см. схему) и в каждую из них наливают соответственно следующие ингредиенты: специфическая сыворотка, специфический антиген, нормальная сыворотка, искомый антиген. Если искомый антиген соответствует сыворотке, то между соответствующими луночками должна появиться линия преципи­тации. Линия преципитации должна также появиться между лунками со специфической сывороткой и специфическим антигеном.

Преципитация наблюдается через 4-5 часов инкубации в термостате во влажной камере.

Схема постановки реакции преципитации в агаре для выявления