Технология получения ферментных препаратов
Производство ферментных препаратов осуществляется поверхностным или глубинным способом. В основе поверхностного способа лежит выращивание микроорганизмов на рыхлых питательных средах. Этот способ используется для культивирования микроскопических грибов. При глубинном способе культивирования микроорганизмы выращиваются в толще жидких питательных сред. В этих условиях культивируют как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы. Из поверхностных культур труднее получить высокоочищенные препараты, так как они содержат много балластных веществ. Питательные среды подбирают в зависимости от физиолого-биохимических особенностей микроорганизма-продуцента и того фермента, который необходимо получить.
Технологический процесс состоит из нескольких стадий: приготовление питательной среды; выращивание культуры.
Приготовление питательной среды. Основным компонентом питательной среды для выращивания при поверхностном способе культивирования являются пшеничные отруби, свекловичный жом, зерновая шелуха и солодовые ростки. Для получения рыхлой структуры к средам добавляют древесные опилки (5-10 %), солодовые ростки, овсяную шелуху (15-20 %). Для глубинного культивирования используются кукурузная мука, картофельный крахмал, кукурузный экстракт, свекловичный жом. В состав питательной среды должны входить минеральные вещества (фосфор, сера, цинк, железо, калий, кальций, магний и др.), источники азота (минеральные соли, азот органических соединений, гидролизаты дрожжей).
Подготовка питательной среды состоит в смешивании компонентов среды, увлажнении до 20-40 % (при поверхностном способе) и 90-98 % (при глубинном способе). Готовят среды на водопроводной воде. Стерилизация питательной среды проводится в течение 1,0-1,5 ч при температуре 110-120 0С при избыточном давлении 0,15 МПа. При непрерывной стерилизации используют более высокие температуры (140-145 0С) и меньшую продолжительность (1-10 мин).
Выращивание культуры-продуцента. При поверхностном способе в подготовленную среду с температурой 40 0С при непрерывном перемешивании вносят посевной материал и стерильную воду до достижения влажности 58-60 %. Питательную среду раскладывают слоем 2-3 см в кюветах или 4-5 см в вертикальных кассетах. Выращивание происходит в растильных камерах или механизированных установках при температуре 28-32 0С в течение 22-40 ч. В процессе выращивания культура продувается кондиционированным воздухом для поддержания температурно-влажностного режима, иначе культура подсыхает и снижается ферментативная активность. Одновременно удаляется избыток диоксида углерода, который накапливается в процессе дыхания.
Готовая культура представляет собой брикет влажностью 35-58 %, в котором частицы питательной среды связаны мицелием. Этот продукт неустойчивый. В результате дыхания и выделяющегося тепла ферменты могут инактивироваться в течение трех часов. Для сохранения активности культуры ее необходимо высушить до влажности 10-13 %. Для ускорения сушки культуру измельчают на дробилках до размера частиц 2-3 мм. Сушат на ленточных, шахтных сушилках. Основное условие сушки – продолжительность 5-8 мин, температура не выше 40-42 0С. Высушенную культуру фасуют в бумажные мешки с полиэтиленовыми вкладышами. Полученная культура имеет маркировку Пх.
Выращивание культуры глубинным способом осуществляется в ферментаторах. Это вертикальная емкость с мешалкой, подогревом и аэрирующим устройством. Ферментатор заполняется подготовленной средой на 65-75 % в зависимости от степени пенообразования при росте культуры, вносится посевной материал и производится культивирование. Гашение пены производится с помощью пеногасителя (жиры, масла). В процессе культивирования растущая культура аэрируется стерильным воздухом. Продолжительность культивирования зависит от вида получаемого препарата: амилазы – 21-30 ч, цитолитических ферментов – от 2-х до 10 суток. Температура культивирования для амилолитических, пектолитических и протеолитических ферментов 30-38 0С, для протеолитических – 25 0С. рН для грибов 3,8-5,6; для бактерий 6,2-7,4. Готовая культуральная жидкость содержит отдельные микробные клетки или мицелий, продукты биосинтеза и остатки питательной среды, сухих веществ от 1 до 5 %. Она представляет собой неочищенный ферментный препарат с индексом Гх.
Очищенные ферментные препараты имеют ряд преимуществ по сравнению с исходной культурой. Они содержат ферменты в концентрированном виде, долго сохраняют свою активность, не содержат спор микроорганизмов-продуцентов ферментов. Очищенные препараты получают из водных растворов. Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов.
Принципиальная схема получения и очистки ферментных препаратов приведена на рисунке 22.
Для получения таких очищенных препаратов культуру продуцента, выращенную поверхностным способом, освобождают от нерастворимых балластных веществ (остатков твердой питательной среды и мицелия). Так как ферменты это водорастворимые белки, то лучшим экстрагентом для них является вода.
Для выделения ферментов используется противоточная экстракция в диффузионных батареях. В диффузор загружается культура влажностью 50-55 %, экстракция проводится водой с температурой 25-27 0С с добавлением антисептика (например, формалина) с выдержкой по 30 мин в каждом аппарате. Полученная диффузионная вытяжка содержит 10-12 % сухих веществ. Ее сгущают при температуре 30-32 0С в вакуум-выпарных аппаратах до содержания сухих веществ 50 %. Полученный препарат имеет индекс П2х.
Для получения препарата с номенклатурой Г2х культуральную жидкость освобождают от биомассы и также концентрируют в вакуум-выпарных установках при температуре 25-30 0С до содержания сухих веществ 50 %. При этом образуется нерастворимый неактивный осадок, который составляет до 10 % сухих веществ, его отделяют сепарированием. Потери активности при концентрировании могут достигать 10 %.
Полученные стандартные сиропы с индексом П2х и Г2х разливают в емкости по 40-50 кг.
При высушивании методом распыления концентрата глубинной культуры с содержанием сухих веществ 10-12 % и диффузионной вытяжки получают препараты с индексом П3х и Г3х. При сушке теряется большое количество сахаров за счет налипания на внутреннюю поверхность сушилки. Для предотвращения этого добавляют хлорид натрия в виде 50 %-ного раствора в количестве 200 мг/м3. Готовые препараты из мельчают и в виде порошка фасуют в мешки с полиэтиленовыми вкладышами.
Для получения препаратов с индексом П10х и Г10х очистку от балластных веществ проводят в непрерывно действующих сепараторах. Ферменты осаждают органическими растворителями (этанол, метанол, изопропанол, ацетон) или неорганическими высококонцентрированными солевыми растворами (сернокислый марганец). Для сокращения потерь осаждение проводят при рН 6,0-6,2 (подкисляют уксусной кислотой) и температуре минус 5 – минус 6 0С. Отделение ферментного осадка проводят центрифугированием. Затем осадок промывают 96 %-ным этиловым спиртом и направляют на сушку. Влажность осадка 30-35 %. Сушка проводится в вакуум-сушильный аппаратах, распылительных или сублимационных сушилках до влажности 10-13 %. Сухой продукт измельчают и фасуют в полиэтиленовые пакеты массой по 0,5 кг.
Препараты с такой степенью очистки являются массовыми, относительно недорогими и широко используются в различных отраслях пищевой промышленности.
Для получения более высокоочищенных ферментных препаратов используют современные методы очистки: диализ, электродиализ, обратный осмос, ультрафильтрацию, микрофильтрацию.
Диализ и электродиализ основаны на разделении растворенных веществ посредством мембран, которые обладают селективной проницаемостью. Этот метод используется для очистки от низкомолекулярных соединений: сахаров, аминокислот, минеральных солей, более эффективен после осаждения ферментов методом высаливания. Нельзя использовать для выделения α-амилазы, так как этот фермент теряет свою активность.
Барометрические методы: обратный осмос, ультрафильтрация и микрофильтрация отличаются по размерам пор используемых мембран. Это очень дорогие методы, используются для получения высокоочищенных, дорогостоящих ферментных препаратов.
Выпускаемые ферментные препараты представляют собой либо жидкости, либо порошки белого, серого или желтоватого цвета с определенной стандартной активностью ферментов.