2.1.4. Цветная проба

Цветная проба (или цветная реакция) основана на разнице в цвете среды индикатором фенолрот, в которой растёт нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, заражённая вирусом. В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (рН 7,4 – 7,6), вследствие снижения рН до 7,0 – 6,8 приобретает жёлтый цвет.

Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: происходит подавление процессов метаболизма, значительно понижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды остаётся на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остаётся красного цвета.

С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры.

Цветную пробу ставят с различными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые культуры клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма. Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку.

При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100-200 тыс. в 1 мл. Из неё делают ряд возрастающих разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый н 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза – 25 тыс. клеток в объёме 0,25 мл.

Титрование вируса методом цветной пробы

Цветную пробу ставят в пробирках, которые иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаиванием стерильного вазелинового масла (0,6-0,8 мл) или применение алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают в четыре пробирки.

При оценке результатов реакции учитывают два тона: жёлтый и красный (табл. 3).

При титровании вируса по цветной пробе готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала. Эти разведения вируса, взятые в объёме 0,25 мл, смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объёме, добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0,6-0,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1,1/2 и ¼ дозы клеток. Пробирки помещают на 5-6 дней в термостат при 37⁰С после чего по изменению цвета учитывают реакцию.

Титром вируса по цветной пробе называется то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В данном примере (табл. 3) титр вируса равен 10^-4 (две пробирки красные, две – жёлтые). Количество вируса, содержащееся в объёме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой (ЦПД₅₀) вируса.

Таблица 3

Схема титрования вируса методом цветной пробы

Ингредиенты опыта (в мл)	№ пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Разведения вируссодержащего материала						Контроль клеток
	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	1 доза	½ доза	¼ доза
Вируссодержащий материал	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-	-	-
Взвесь клеток (1 доза)	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Питательная среда	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,5	0,5	0,5
Вазелиновое масло	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
Возможные результаты
Цвет среды в пробирках (красный или жёлтый)	К-4	К-4	К-3 Ж-1	К-2 титр Ж-2	К-1 Ж-3	Ж-4	Ж-4	Ж-2 К-2	К-4
Обозначения:	К-4 – красного цвета 4 пробирки; Ж-3 – жёлтого цвета 3 пробирки