1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии

- Электронная микроскопия

Электронноскопические препараты готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражённых вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плёнки-подложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-подложки должны быть очень тонкими (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными, например, коллоидийно-угольные. Плёнки наносят на поддерживающие сеточки из меди (диаметром 2-3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами.

Методы напыления металлами применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на вируссодержащий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла.

Метод негативного контрастирования основан на том, что при обработке препарата некоторыми солями тяжёлых металлов, например, 1-2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, создаётся более плотный слой, не пропускающий электроны, а котором хорошо видны более электроннопрозрачные исследуемые объекты.

Метод ультратонких срезов в сочетании с негативным контрастированием является наилучшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этапов взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиболее сложен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодержащего материала фиксируют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обезвоживают путём последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной 10-20 нм на специальном микротоме, Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Приготовленные вышеописанными способами препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0,2-0,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюаресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Получаемые увеличения: ×100000-×400000.

Сканирующая электронная микроскопия осуществляется с помощью сканирующего электронного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, проходя через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изображение объекта на флюоресцирующем экране.

Сканирующая микроскопия позволяет получать трёхмерное изображение вирионов (предварительно препарат напыляют металлами), различать детали строения их поверхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующего микроскопа равна 7-20 нм.

- Световая микроскопия

В световом микроскопе можно увидеть крупные вирусы, размеры которых находятся в пределах разрешающей способности микроскопа - не менее 0,2 мкм. А также внутриклеточные включения в поражённых вирусом тканях.

Крупные вирусы, например, поксвирусы, и включения обнаруживают с помощью специальных методов окраски, в фазовом контрасте, в тёмном поле зрения; применяют и люминесцентную микроскопию.

Крупные вирусы выявляют путём окраски по Морозову (серебрением). Для выявления внутриклеточных включений приготавливают гистологические срезы из поражённых тканей, препараты-мазки или отпечатки. Обычно препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе, иногда другими методами. Наибольшее практическое значение имеет обнаружение включений Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга при бешенстве. Для этого препараты окрашивают по Манну.

Люминесцентная микроскопия. Препараты, приготовленные из материалов, содержащих крупные вирусы, внутриклеточные включения, скопления вирусных антигенов, окрашивают растворами флюорохромных красителей. При люминесцентной микроскопии в УФ-свете окрашенные акридин-оранжевым скопления РНК-геномных вирусов и образуемые ими включения видны как светящиеся красные гранулы на фоне бледно-зелёной цитоплазмы клеток; ДНК-геномные вирусы дают изумрудно-зелёное свечение.

Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении вирусов, внутриклеточных включений, скоплений вирусных антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченными флюорохромными красителями. Образовавшиеся комплексы дают свечение при люминесцентной микроскопии.