2.3. Молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций

К таким методам относятся молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция, которые позволяют обнаружить присутствие в исследуемом материале даже единичных копий генов определяемых вирусов (ДНК или РНК с определённой нуклеотидной последовательностью), и тем самым доказать наличие соответствующей инфекции.

2.3.1. Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов)

Метод основан на способности двухспиральной ДНК к денатурации и ренатурации. Денатурация – это расхождение цепей при нагревании ДНК до 80-100⁰С или обработке её щёлочью. Ренатурация – воссоединение цепей с помощью водородных связей при снижении температуры до 40-60⁰С (отжиг) и приобретение ДНК первоначальной двухспиральной структуры. Разъединённые цепи ДНК способны к гибридизации с фрагментами других односпиральных ДНК, имеющих комплементарные участки расположения нуклеотидов. К гибридизации комплементарных нитей способна также РНК, образуя комплексы ДНК – РНК или РНК – ДНК.

Необходимые для молекулярной гибридизации фрагменты ДНК или РНК, с помощью которых выявляют наличие в исследуемом материале комплементарных нитей нуклеиновой кислоты, называются молекулярными зондами. Молекулярные зонды готовят из нуклеиновых кислот, выделенных из различных вирусов, иногда используют вирусную и-РНК, но чаще зондом служит клонированная рекомбинантная ДНК. Имеются наборы молекулярных зондов для определения многих вирусов.

При постановке реакции молекулярной гибридизации зонды метят радиоактивной (Р₃₂), флюоресцентной или биотиновой меткой, соединяют с исследуемым материалом, содержащим определяемую нуклеиновую кислоту, подвергающуюся денатурации. Если зонд комплементарен цепи определяемой нуклеиновой кислоты, происходит гибридизация в комплементарном участке.

После отжига зонд оказывается включённым в ренатурированную нуклеиновую кислоту и может быть обнаружен по имеющейся метке. Выявление наступившей молекулярной гибридизации позволяет установить природу определяемого вируса. Чувствительность этого метода составляет 10^-14 г/мл.

2.3.2. Полимеразная цепная реакция (пцр) или локальная

амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)

ПЦР, как и молекулярная гибридизация, основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации и на комплементарности цепей ДНК. Важным принципом реакции является использование термостабильной ДНК-полимеразы, при участии которой происходит амплификация – умножение определяемых генов или фрагментов с определённой нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован. Чувствительность этой реакции составляет 10^-18 г/мл.

В реакции участвуют следующие ингредиенты:

• определяемая ДНК вирусов в испытуемом биологическом материале, который предварительно концентрируется;

• праймеры 2-х типов (олигонуклеотиды) – короткие цепочки ДНК с нуклеотидной последовательностью комплементарной 3^,-концам каждой из двух цепей определяемой ДНК. Праймеры получают из нуклеиновых кислот различных вирусов, их нуклеотидную последовательность определяют методом секвенирования;

• свободные нуклеитиды (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты 4-х типов с различными азотистыми основаниями) – необходимый материал для осуществления амплификации;

• фермент термостабильная ДНК-полимераза – производит достройку комплементарных цепей ДНК из пула свободных нуклеотидов. Фермент выделяют из бактерий Thermus aquaticus или получают генно-инженерным методом.

Сущность ПЦР состоит в том, что определяемая ДНК, находящаяся в тестируемом биологическом материале, подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отжига присоединяются, вследствие их комплементарности, к 3^,-концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат «затравками» для последующей достройки цепей ДНК, осуществляемой термостабильной ДНК-полимеразой, которая использует для этой цели свободные нуклеотиды.

В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается, то есть происходит амплификация ДНК. Обычно проводят 25-40 повторных циклов амплификации и в итоге за 2-3 часа получают миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов.

ПЦР проводят в 0,5-1,5 мл микроцентрифужных пробирках в амплификаторах, которые автоматически регулируют смену температуры. Каждому из 3-х этапов цикла амплификации – денатурации ДНК, отжига и достройки – необходима инкубация образцов при различном температурном режиме.

1. Денатурация – разъединение определяемой двухспиральной ДНК на две изолированные цепи при нагревании до 90-95⁰С в течение 0,5-1,0 мин.

2. Отжиг – восстановление двухцепочечной структуры определяемой ДНК в области присоединения комплементарного праймера – проводится при температуре 40-60⁰С 0,5 мин.

3. Удлинение (элонгация) – достройка каждой цепи определяемой ДНК доисходного двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК-полимеразы – проводится при температуре 70-75⁰С в течение 2-5 мин.

Наличие ДНК после повторных циклов амплификации определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, авторадиографией или другими методами.

С помощью ПЦР возможно определение не только нуклеотидной последовательности ДНК, но также РНК и, следовательно, выявление РНК-вирусов (для этого в реакцию вводят обратную транскриптазу). ПЦР особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекции.

Рис. 8. Схема полимеразной цепной реакции

Контрольные вопросы

1. Индикация вируса по его цитопатическим действиям (ЦПД) и определение титра вируса. Идентификация вируса по нейтрализации ЦПД.

2. Метод гемадсорбции, его практическое применение, идентификация вируса в реакции задержки гемадсорбции.

3. Метод бляшек. Идентификация вирусов методом бляшек, титрование антител.

4. Метод цветной пробы, методика постановки, практическое применение.

5. Реакция нейтрализации по цветной пробе, её сущность, применение.

6. Реакция гемагглютинации (РГА), вызываемая вирусами. Практическое применение РГА. Методика постановки.

7. Сущность реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Методика постановки. Практическое применение.

8. Реакция нейтрализации вирусов in vivo, способы постановки. Практическое применение.

9. Молекулярно-генетические методы исследования, их сущность. Принцип метода молекулярной гибридизации.

10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Ингредиенты реакции, их характеристика, значение амплификации. Сущность ПЦР.

11. Техника постановки ПЦР, практическое применение и оценка, как экспресс-метода диагностики вирусных инфекций.

Тематика докладов

1. Современные методы диагностики распространённых вирусных инфекций.

2. Индикация и идентификация вирусов гриппа.

3. Молекулярно-генетические методы анализа полиморфизма генов.

4. Молекулярно-генетические методы анализа экспрессии генов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд. – М.: Медицина, 1982.

2. Большой словарь медицинских терминов / Сост. Федотов В.Д. – М.: ЗАО Центрполиграф, 2007.

3. Вирусология. Методы / Под ред. Б. Мейхи. – М.: Мир, 1988.

4. Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология. – М.: АСАDEMA, 2003.

5. Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник.

6. ПЦР «в реальном времени» / Под ред. Д.В. Ребрикова; 2-е изд., испр. И доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.

7. Филдс Б., Найп Д. Вирусология. Т. 1-3. – М.: «Мир», 1989.

8. www. infections.ru/rus/all/mvb journals.shtml

9. www.blackwellmedstudent.com

10. www.medmaster.net

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….... 3