- •Раздел 1. Культивирование вирусов
- •1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований
- •1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории
- •1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях
- •1.1.3. Обработка вируссодержащего материала
- •1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии
- •1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения
- •1.2.1. Питательные среды
- •1.2.2. Типы клеточных культур
- •1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах
- •1.3.1. Строение куриного эмбриона
- •1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку
- •1.3.3. Заражение в аллантоиную полость
- •1.3.4. Заражение в полость амниона
- •1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных
- •1.4.1. Интраназальное заражение
- •1.4.2. Интрацеребральное заражение
- •Раздел 2. Индикация и идентификация вирусов
- •Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах
- •2.1.1. Цитопатическое действие (цпд) вируса в культуре клеток
- •2.1.2. Реакция гемадсорбции
- •2.1.3. Метод бляшек
- •2.1.4. Цветная проба
- •Применение реакции гемагглютинации (рга), реакции торможения гемагглютинации (ртга) и биологических моделей для индикации и идентификации вирусов
- •2.2.1. Техника постановки рга
- •2.2.2. Техника постановки ртга
- •2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo
- •2.3. Молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций
- •2.3.1. Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов)
- •2.3.2. Полимеразная цепная реакция (пцр) или локальная
- •Раздел 1. Культивирование вирусов ……………………………………………4
- •Раздел 2. Индикация и идентификация вирусов………………………………26
1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах
Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды.
Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов. Но этот метод имеет недостатки: 1) невозможно наблюдать в динамике за патологическими изменениями, происходящими в эмбрионе после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбриона, зараженного вирусом, часто не обнаруживается видимых изменений и приходится выявлять наличие вируса в тканях, в жидкостях эмбриона, пользуясь другими вирусологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) метод культивирования в куриных эмбрионах пригоден не для всех вирусов. Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами.
1.3.1. Строение куриного эмбриона
Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает зародыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединён с желточным мешком – основным источником питательных веществ.
Для успешного культивирования вирусов в организме развивающихся куриных эмбрионов требуется определённый температурный режим (360-380), влажность (50-70%), а также достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со стерильным парафином, покровные стёкла, пакетики стерильной ваты и марли, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы. Инструменты помещают в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли.
Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают.