- •Разработка люминесцентного метода выявления эндоспор у бактерий
- •«Вятский государственный университет» (фгбоу впо «ВятГу»)
- •Задание на дипломную работу
- •Календарный план работы
- •Реферат
- •Содержание
- •Введение
- •Обзор и анализ научно-технической информации
- •1 Роль спорообразующих бактерий в биотехнологии
- •2. Физиологические и морфологические изменения, сопровождающие споруляцию и прорастание спор
- •2.1 Условия и стадии споруляции
- •2.2 Свойства зрелых спор, прорастание спор
- •3 Споруляционные белки проспоры, споры и материнской клетки
- •4 Препараты фиксированных окрашенных клеток и спор микроорганизмов
- •4.1 Приготовление мазка и фиксация препарата
- •4.2 Методы, основанные на использовании для окраски эндоспор бактериологических красителей
- •4.2.1 Метод Циля-Нильсена
- •4.2.2 Метод Ожешко
- •4.2.3 Метод Шеффера-Фултона
- •4.3 Способы негативного окрашивания эндоспор
- •4.4 Прижизненное выявление эндоспор при помощи фазово-контрастной микроскопии
- •4.5 Методы люминесцентной окраски эндоспор
- •5. Выводы по обзору научно-технической и патентной информации
- •Техническое и социально-экономическое обоснование темы. Задачи дипломной работы
- •Основная часть
- •1 Материалы и методы
- •1.1 Микробные тест-культуры
- •1.2 Питательные среды, растворы и реактивы
- •1.3 Оборудование и приборы
- •1.4 Методы исследований
- •2 Разработка люминесцентного метода выявления эндоспор
- •2.1 Изучение диагностической эффективности известных методов окраски эндоспор
- •2.2 Разработка люминесцентного метода выявления эндоспор
- •2.3 Сравнение диагностической эффективности методов окраски эндоспор бактериологическими красителями и разработанного метода
- •3 Выводы по разделу
- •1 Структура декомпозиции работ по уровням
- •2 Организационная структура проекта
- •3 Ресурсы
- •4 Таблицы назначений ресурсов по операциям
- •5 Расчет стоимости операций
- •6 Бюджет затрат
- •7 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Экологическое обоснование темы дипломной работы
- •2 Свойства применяемых реактивов и препаратов
- •3 Потенциальные опасности при выполнении экспериментальной части работы
- •4 Разработка мероприятий по безопасному проведению работ
- •4.1 Организация рабочего места
- •4.2 Меры безопасности при работе с реактивами
- •4.3 Меры безопасности при работе со стеклянной посудой
- •4.4 Меры безопасности при работе с электроприборами
- •4.5 Меры безопасности при работе с микроорганизмами
- •4.6 Промышленные средства индивидуальной защиты
- •4.7 Первая доврачебная помощь при химических и термических ожогах
- •5 Производственная санитария
- •5.1 Санитарно-гигиеническая характеристика лаборатории
- •5.2 Метеоусловия
- •5.3 Отопление
- •5.4 Вентиляция
- •5.5 Освещение
- •5.6 Водоснабжение
- •5.7 Канализация
- •5.8 Пожарная профилактика
- •6. Выводы по разделу
- •Заключение
- •Приложение 1
- •Авторская справка
- •Приложение 2
- •Перечень принятых определений и терминов
- •Приложение 3
- •Перечень принятых обозначений и сокращений
- •Приложение 4
- •Люминесцентный метод окраски бактериальных эндоспор
- •Приложение 5
- •Приложение 6
- •Приложение 7
- •Список использованных источников
4.2.2 Метод Ожешко
Реактивы
1. Вещество, нарушающее структуры споровых оболочек – 0,5% раствор соляной кислоты.
2. Красители: карболовый фуксин Циля, метиленовая синька Леффлера, 1% раствор малахитового зеленого.
3. Обесцвечивающий фактор: 5% раствор серной кислоты .
Методика
1. На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5% раствора соляной кислоты и подогревают 1-2 минуты над пламенем горелки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.
2. Остывший препарат промывают водой, подсушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают карболовым фуксином Циля (фуксин наливают на фильтровальную бумагу) с подогреванием до появления паров.
4. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение нескольких секунд.
5. Промывают водой.
6. Докрашивают синькой Леффлера или 1% раствором малахитового зеленого в течение 3-5 минут.
7. Промывают водой, высушивают и смотрят под иммерсией.
Результат
Споры, окрашенные фуксином, имеют рубиново-красный цвет, вегетативные тела микробных клеток при докрашивании синькой Леффлера – синий цвет, при применении малахитового зеленого – зеленый цвет [35].
4.2.3 Метод Шеффера-Фултона
Реактивы
1. Красители: 0,5% водный раствор малахитового зеленого, фуксин Пфейфера
Методика
1. На мазки, фиксированные над огнем, накладывают фильтровальную бумагу и окрашивают 0,5% водным раствором малахитового зеленого.
2. Помещают на кипящую водяную баню на 5-10 минут.
3. Бумагу сбрасывают, промывают в проточной воде.
4. Докрашивают фуксином Пфейфера в течение 30 секунд.
5. Промывают водой, сушат и изучают при масляной иммерсии.
Результат
Споры окрашиваются в зеленый цвет, бактерии – в красный [36].
4.3 Способы негативного окрашивания эндоспор
Красители можно разделить на две группы – позитивные и негативные. Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты, негативными – красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя.
При окрашивании негативными красителями среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно темном фоне. Микроорганизмы и структуры, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, например спирохеты и внеклеточная слизь, легко выявляются при окрашивании негативными красителями. Споры имеют вид преломляющих свет включений в вегетативных клетках.
Окрашивание негативными красителями можно провести двумя способами: либо краситель наносят на сухой фиксированный мазок и дают раствору красителя высохнуть, либо на край стекла наносят по капле раствора красителя и суспензии бактерий, после чего обе капли смешивают и, не давая смеси высохнуть проводят мазок вдоль стекла. Чаще всего для негативного окрашивания используют тушь, 10%-ный водный раствор нигрозина или 2%-ный водный раствор конго красного. Нигрозин представляет собой смесь желтого и синего красителе; он окрашивает фон в черный цвет. После окрашивания конго красным высушенные мазки следует погрузить в 1%-ный раствор соляной кислоты в абсолютном этаноле, в результате чего фон красится в темно-синий цвет [32].