Приложение 4

(справочное)

Люминесцентный метод окраски бактериальных эндоспор

Реактивы

3. Красители: 0,1% раствор аурамина ОО в 0,3% феноле на дистиллированной воде; 0,01% водный раствор корифосфина.

4. Обесцвечивающий фактор: 0,5% раствор солянокислого спирта

Методика

7. Фиксация мазков на пламени.

8. Флюорохромирование препаратов 0,1% раствором аурамина ОО. Окрашивание продолжается в течение 1-2 минут.

9. Дифференциация 0,5% раствором солянокислого спирта.

10. Тщательное промывание в воде.

11. Дополнительная окраска в течение 40 секунд в растворе корифосфина.

12. Промывание водой и высушивание на воздухе.

Результат

Споры флюоресцируют зелено-желтым светом, а все другие неспорообразующие бактерии и вегетативные формы спороносных бактерий флюоресцируют оранжевым светом (рис. 1,2).

Рисунок 1. Культура Bacillus thuringiensis, окрашенная по люминесцентному методу окраски бактериальных эндоспор.

Рисунок 2. Культура Bacillus cereus, окрашенная по люминесцентному методу окраски бактериальных эндоспор.

Приложение 5

(Справочное)

Доклад

Слайд 1

Глубокоуважаемый председатель, глубокоуважаемые члены комиссии и все присутствующие, вашему вниманию представляется доклад по дипломной работе на тему «Разработка люминесцентного метода выявления эндоспор у бактерий».

Слайд 2

Работа выполнена на кафедре микробиологии Вятского государственного университета.

Слайд 3

Современная бактериология располагает довольно обширным набором методом выявления эндоспор. Условно их можно разделить на четыре группы. Это методы, основанные на использовании бактериологических красителей, методы фазово-контрастной микроскопии, методы негативного окрашивания и люминесцентная микроскопия.

Одним из преимуществ методов люминесцентной микроскопии является высокая чувствительность при выявлении эндоспор, однако Люминесцентная микроскопия не нашла широкого применения в микробиологической практике из-за использования в качестве флюорохрома бриллиантсульфофлавина, который является труднодоступным реактивом.

Поэтому разработка нового люминесцентного метода окраски бактериальных эндоспор, который был бы прост в исполнении и нагляден, является актуальной.

Слайд 4

Целью данной работы является изучение особенностей наиболее известных методик окраски эндоспор и разработка люминесцентного метода выявления эндоспор, позволяющего получать наиболее информативные препараты.

Слайд 5

Для достижения поставленной цели необходимо:

1. изучить особенности наиболее известных методик окраски бактериальных эндоспор;

2. Экспериментально установить степень влияния химических реактивов (веществ, повышающих проницаемость споровой оболочки, дифференцирующих растворов, красителей) на результаты окрашивания;

3. На основании полученных результатов предложить метод окраски бактериальных эндоспор, основанный на использовании флюорохромов и люминесцентного микроскопа.

Слайд 6

В исследованиях были использованы 3 грамположительных микроорганизма – это Bacillus cereus Bacillus licheniformis

Слайд 7

И Bacillus thuringiensis.

Слайд 8

Все способы окраски спор основаны на одном принципе. Сначала споры обрабатывают разными веществами – хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода в целях нарушения проницаемости споровых оболочек, затем окрашивают клетку со спорой при нагревании, наконец, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастными красителем.

Слайд 9

На первом этапе исследований нам необходимо было получить количественную информацию о диагностической эффективности существующих в микробиологической практике методов окраски бактериальных эндоспор. С этой целью из каждой тест-культуры готовили мазки в строгом соответствии с известной методикой окраски. Полученные препараты исследовали под микроскопом. Результаты анализа представлены на слайде.

Слайд 10

Область применения данных методов выявления спор ограничена лишь возможностью исследования высококонцентрированных бактериальных суспензий. Применительно к низко концентрированным материалам данные методы в силу особенностей световой микроскопии по методу светлого поля малоприменимы, так как глаза человека плохо замечают единичные окрашенные объекты на светлом фоне. В этом отношении более предпочтительно использовать люминесцентную микроскопию, которая в большей степени соответствует особенностям органа зрения замечать единичные светящиеся объекты на темном фоне. В силу отмеченных обстоятельств представилось целесообразным испытать возможности люминесцентной микроскопии для выявления эндоспор.

Слайд 11

При разработке люминесцентного метода выявления эндоспор нам требовалось подобрать флюорохромы таким образом, чтобы свечение эндоспор и бактериальных клеток было как можно более контрастным по цвету и находилось в различных частях спектрах света. Такие условия могли создаться в том случае, если бы вегетативные клетки имели красное свечение, а споры – зеленое. Исходя из требований, нами были выбраны флюорохромы, которые наиболее широко применяются в микробиологической практике, и испытаны в экспериментах по подбору флюорохромов, обеспечивающих надежную дифференцировку по цвету эндоспор и клеток. На основании проведенных экспериментов можно сделать вывод, что наилучший результат наблюдается при окрашивании аурамином 00 и корифосфином, так как при этом наблюдается более контрастная картина окраски эндоспор и бактериальных клеток.

Слайд 12

Необходимым этапом при выявлении эндоспор является этап дифференцировки, в ходе которого с целью снижения ложноположительных результатов производят обработку эндоспор и вегетативных клеток веществами, экстрагирующими краситель из тела вегетативных клеток. Обесцвечивание достигается довольно просто, так как адсорбированный спорой краситель удерживается прочнее, чем краситель, адсорбированный цитоплазмой клетки. Обесцвечивающий раствор солянокислый спирт был испытан в экспериментах. Мазки фиксировали и окрашивали в соответствии с методом, после проводили микроскопию и подсчитывали не менее 600 клеток и спор в мазке. Результаты представлены на слайде.

Слайд 13

В результате проведенных экспериментов по подбору флюорохромов и обесцвечивающего раствора, можно предложить следующую методику выявления бактериальных эндоспор.

Методика окраски бактериальных эндоспор флюорохромами.

6. Фиксация мазков на пламени.

7. Окраска препаратов 0,1% раствором аурамина ОО в 0,3% фенола на дистиллированной воде. Окрашивание продолжается в течение 1-2 минут.

8. Дифференциация 0,5%-м раствором солянокислого спирта.

9. Тщательное промывание в воде.

10. Дополнительная окраска в течение 40 секунд в водном растворе корифосфина (0,01%).

11. Промывание водой и высушивание на воздухе.

При такой окраске препарата споры флюоресцируют зелено-желтым светом, а все другие неспорообразующие бактерии и вегетативные формы спороносных бактерий флюоресцируют оранжевым светом.

Слайд 14

Для решения вопроса о целесообразности использования разработанного метода в практике микробиологических исследований представилось необходимым испытать его эффективность в сопоставлении с известными методиками.

В сравнительных экспериментах разработанного метода в сопоставлении с известными классическими методами окраски эндоспор, основанными на применении бактериальных красителей, было установлено, что результаты, полученные при помощи разработанного метода, почти всегда совпадают либо превышают результаты классических методов окраски.

Слайд 15

При сравнении чувствительности разработанного метода и классических методов выявления эндоспор готовили суспензии тест-культуры Bacillus thuringiensis Производили ряд последовательных разведений и делали мазки из этих разведений. Высушенные и зафиксированные над пламенем спиртовки мазки окрашивали в соответствии с методом Шеффера-Фултона, Циля-Нильсена и разработанным методом. При микроскопировании подсчитывали количество спор в одном поле зрения. На основании проведенного эксперимента можно судить, что разработанный метод является более чувствительным по сравнению с методом Шеффера-Фултона и методом Циля-Нильсена.

Слайд 16.

Проведенные нами исследования дают основания рекомендовать разработанный люминесцентный метод выявления эндоспор для применения в практике микробиологических исследований.

Слайд 17

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:

1. Существующие методы выявления эндоспор имеют существенные различия в составе красителей, растворов для дифференцировки, обесцвечивающих растворов, что влияет на конечный результат исследования.

2. Подобраны флюорохромы, пригодные для выявления эндоспор. Наилучший результат наблюдается при окрашивании аурамином 00 и корифосфином, так как при этом наблюдается более контрастная картина окраски эндоспор и бактериальных клеток.

Слайд 18

3. С целью снижения ложноположительных результатов выявления эндоспор был предложен в качестве дифференцирующего раствора солянокислый спирт.

4. Разработанный метод по чувствительности и процентному содержанию окрашенных спор значимо превосходит классические способы окраски.

Слайд 19

Разработанный люминесцентный методы выявления бактериальных эндоспор рекомендуется внедрить в практику работы кафедры микробиологии ВятГУ.

Слайд 20

Результаты работы в виде тезисов представлены в сборнике материалов Всероссийской ежегодной научно-технической конференции «Общество, наука, инновации», 2013 г.

Слайд 21

Автор выражает глубокую благодарность за помощь в выполнении дипломной работы научному руководителю д. м. н., профессору Золотареву Александру Георгиевичу и Бузикову Рустаму Мансуровичу.

Слайд 22

Доклад окончен. Спасибо за внимание!