2.2 Разработка люминесцентного метода выявления эндоспор

Подавляющее большинство микроорганизмов не обладает собственной флюоресценцией, и по этой причине для придания им способности светиться в люминесцентном микроскопе их предварительно пропитывают (флюорохромируют) флюоресцирующими реактивами, получившими название флюорохромов или световых составов. Это природные или синтетические соединения, которые отличаются способностью излучать видимый свет (люминесцировать) после облучения ультрафиолетовыми, фиолетовыми и синими лучами. Спектр возникшей люминесценции сдвинут по отношению к спектру возбуждающего света в сторону более длинных волн.

Люминесцентные методы окраски отличаются высокой чувствительностью по сравнению с другими способами микроскопического выявления эндоспор.

Однако, люминесцентная микроскопия не нашла широкого применения в практике выявления эндоспор бактерий. Все известные к настоящему времени публикации по этому вопросу ограничены методом Хагеманна. Этот метод основан на применении двух флюорохромов. Один из них (бриллиантсульфофлавин) труднодоступный и в широкой микробиологической практике не используется, что явилось, на наш взгляд, одной из причин ограниченного применения данного метода.

В этой связи нам, исходя из преимуществ люминесцентного анализа, требовалось подобрать флюорохромы, пригодные для дифференцированной окраски эндоспор и вегетативных клеток, определить их рабочую концентрацию, время и условия флюорохромирования. Решить эту задачу нам требовалось таким образом, чтобы флюорохромное свечение эндоспор и бактериальных клеток было как можно более контрастным по цвету и находилось в различных частях спектрах света. Исходя из задач, мы, прежде всего, решили выбрать из известных флюорохромов те реактивы, которые бы обеспечивали нам четкие различия по цвету флюоресценции эндоспор и вегетативных клеток.

Таблица 4. Свойства флюорохромов, наиболее часто используемых для флюорохромирования микроорганизмов

Наименование флюорохрома	Цвет люминесцен-ции	Используемые концентра-ции, %	Время окраски, мин	Область применения
Акридиновый оранжевый	Зеленый, красный, оранжевый	0,1-0,00001	0,5-2	Окраска живых или фиксированных бактерий, простейших, грибов
Акридиновый желтый	Желтый	0,1-0,01	1-2	То же
Акрифлавин	Желтый	1,0-0,1	0,5-3	Окраска фиксированных бактерий, простейших и грибов
Аурамин 00	Желтый, ярко зеленый	0,3-0,05	1-5	Окраска кислотоустойчивых бактерий, спор, грибов
Берберин-сульфат	Желтый	0,01-0,0001	0,5-2	Окраска фиксированных бактерий и спор
Корифосфин	Желтый	0,01-0,001	1-2	Окраска фиксированных бактерий, спор и грибов
Родамин Ж	Оранжевый	0,1-0,001	1-5	Витальная окраска бактерий и грибов
Родамин В	Оранжево-красный	0,1-0,05	1-10	Выявление липидов, спор
Риванол	Желто-зеленый	0,1-0,01	1-5	Окраска фиксированных бактерий, простейших
Примулин	Желто-зеленый, голубой	0,1-0,0002	1-2	Выявление бактерий, вирусов, простейших, грибов
Конго красный	Красный	0,01-0,001	1-3	Прижизненная окраска
Кислотный фуксин	Красный	0,01-0,005	1-2	То же
Титановый желтый	Синий	0,01-0,001	0,5-5	Окраска фиксированных бактерий
Флюоресцеин-натрий (уранил)	Желто-зеленый	1,0-0,1	0,5-3	То же
Эозин Н	Желтый	0,1-0,01	1-5	То же

Такие условия могли создаться в том случае, если бы вегетативные клетки имели красное свечение, а споры – зеленое. Исходя из данных таблицы 4,в указанных условиях можно использовать риванол, аурамин 00, берберинсульфат для окраски спор, а для окраски клеток – корифосфин, родамин Ж, родамин В и акрединовый оранжевый. Флюорохромы были испытаны в экспериментах по подбору флюорохромов, обеспечивающих надежную дифференцировку по цвету эндоспор и клеток, в качестве тест-культуры использовалась культура Bacillus thuringiensis. Мазки фиксировали и окрашивали различными флюорохромами в соответствии с методом Хагеманна, после проводили микроскопию и подсчитывали не менее 600 клеток и спор в мазке. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты флюорохромирования эндоспори вегетативных клеток различными флюорохромами.

Флюорохромы	Результат окраски	Содержание спор в мазках , %
Аурамин 00 + корифосфин	Споры ярко-зеленые, вегетативные клетки оранжево-красные	71±0,1
Аурамин 00 + родамин Ж	Споры ярко-зеленые, вегетативные клетки золотисто-желтые	43±0,2
Аурамин 00 + акридиновый оранжевый	Споры ярко-зеленые, вегетативные клетки золотисто-желтые	47±0,2

На основании проведенных экспериментов можно сделать вывод, что наилучший результат наблюдается при окрашивании аурамином 00 и корифосфином, так как при этом наблюдается более контрастная картина окраски эндоспор и бактериальных клеток. Сочетания аурамин 00 с родамином Ж либо аурамин 00 с акридиновым оранжевым обеспечили значительно меньшее выявление эндоспор в той же тест-культуре, так как флюоресценция указанных флюорохромов имеет более близкие спектры, что затрудняет дифференцировку.

Необходимым этапом при выявлении эндоспор является этап дифференцировки, в ходе которого с целью снижения ложноположительных результатов производят обработку эндоспор и вегетативных клеток веществами, экстрагирующими краситель из тела вегетативных клеток. В микробиологической практике с этой целью обычно используются кислоты или спирты. Обесцвечивание достигается довольно просто, так как адсорбированный спорой краситель удерживается прочнее, чем краситель, адсорбированный цитоплазмой клетки.

Обесцвечивающий раствор солянокислый спирт был испытан в экспериментах. Мазки фиксировали и окрашивали в соответствии с методом, после проводили микроскопию и подсчитывали не менее 600 клеток и спор в мазке. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6. Результаты выявления эндоспор бактерий с использованием обесцвечивающего раствора и без него, , %.

Вариант эксперимента	Содержание спор в мазках при микроскопии культуры
	Bacillus thuringiensis	Bacillus cereus	Bacillus licheniformis
С использованием обесцвечивающего раствора	77±0,2	70±0,3	37±0,3
Без обесцвечивающего раствора	83±0,2	79±0,1	48±0,4

В результате проведенных экспериментов по подбору флюорохромов и обесцвечивающего раствора, можно предложить следующую методику выявления бактериальных эндоспор.

Методика окраски бактериальных эндоспор флюорохромами.

Реактивы

1. Красители: 0,1% раствор аурамина ОО в 0,3% феноле на дистиллированной воде; 0,01% водный раствор корифосфина.

2. Обесцвечивающий фактор: 0,5% раствор солянокислого спирта

Методика

1. Фиксация мазков на пламени.

2. Флюорохромирование препаратов 0,1% раствором аурамина ОО. Окрашивание продолжается в течение 1-2 минут.

3. Дифференциация 0,5% раствором солянокислого спирта.

4. Тщательное промывание в воде.

5. Дополнительная окраска в течение 40 секунд в растворе корифосфина.

6. Промывание водой и высушивание на воздухе.

Результат

Споры флюоресцируют зелено-желтым светом, а все другие неспорообразующие бактерии и вегетативные формы спороносных бактерий флюоресцируют оранжевым светом.

Результаты окрашивания представлены на рисунках 8-10.

Рисунок 8. Bacillus thuringiensis

Рисунок 9. Bacillus cereus

Рисунок 10. Bacillus licheniformis