5. Выводы по обзору научно-технической и патентной информации

1. Спорообразующие бактерии имеют важное народно-хозяйственное и промышленное значение, поэтому представляется необходимым заниматься изучением жизненного цикла, спорообразования бактерий родов Bacillus и Clostridium. Одним из важных этапов исследования является обнаружение и изучение структуры и свойств эндоспор, при этом используются различные методы выявления эндоспор.

2. Споры и другие покоящиеся формы формируются у бактерий в процессе клеточной дифференцировки, направленной на выживание в неблагоприятных условиях.

3. Наиболее известными методиками окрашивания бактериальных эндоспор являются методики Циля-Нильсена, Ожешко и Шеффера-Фултона.

4. Данные способы окраски спор основаны на одном принципе. Сначала споры обрабатывают разными веществами – хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода в целях нарушения проницаемости споровых облочек, затем окрашивают клетку со спорой при нагревании, наконец, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастными красителем.

Техническое и социально-экономическое обоснование темы. Задачи дипломной работы

С целью идентификации микроорганизмов в микробиологических лабораториях изучают не только форму и размеры бактериальной клетки, но и отдельные элементы ее структуры: цитоплазму, включения, нуклеотид, оболочку, капсулу, жгутики, споры. Бактериальные эндоспоры представляют собой покоящиеся формы клеток, в которых процессы жизнедеятельности сильно заторможены. Они имеют многослойную оболочку, содержат мало свободной воды и поэтому хорошо переносят различные неблагоприятные воздействия, губительные для вегетативных клеток. Современная бактериология располагает довольно обширным набором методов выявления эндоспор.

Целью данной работы является изучение особенностей наиболее известных методик окраски эндоспор и разработка люминесцентного метода выявления эндоспор, позволяющего получать наиболее информативные препараты. Для достижения поставленной цели необходимо:

• изучить особенности наиболее известных методик окраски бактериальных эндоспор;

• экспериментально установить степень влияния химических реактивов (фиксаторов, протрав, красителей) на результаты окрашивания;

• на основании полученных результатов предложить метод окраски бактериальных эндоспор, основанный на использовании флюорохромов и люминесцентных микроскопов.

Основная часть

1 Материалы и методы

Экспериментальные исследования осуществляли с использованием следующих материалов, оборудования и методов.

1.1 Микробные тест-культуры

Bacillus cereus - грамположительная, спорообразующая бактерия. Хемоорганогетеротроф, факультативный анаэроб, способен к нитратредукции. Метаболизм бродильного или дыхательного типа. Обычно каталазоположительная [40]. Растёт на простых питательных средах, на плотных питательных средах образует плоские, мелкобугристые, слегка вогнутые, матовые колонии. Край волнистый. Клетки крупные 1×3-4 мкм, эндоспоры расположены центрально, не превышают размер клетки. Жгутики расположены перетрихиально. Вызывает пищевые токсикоинфекции у человека (включая рвотный и диарейный синдром), продуцирует энтеротоксины. Диарейный синдром (подобный токсикоинфекции, вызываемой Clostridium perfringens) вызывается высокомолекулярным пептидным токсином, тогда как рвотный синдром (подобный Staphylococcus aureus - ассоциированной токсикоинфекции) вызывается низкомолекулярным термостабильным токсином. Распространена повсеместно [41].

Bacillus thuringiensis - грамположительная, спорообразующая почвенная бактерия. Хемоорганогетеротроф, факультативный анаэроб. Оптимум роста - 29-32^оС. Вегетативные клетки - крупные подвижные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками [40]. Размер клеток (1,5-1,7)×(3,6-6,2) мкм [42]. Образуют термоустойчивую спору, расположенную субтерминально. В центре клетки располагается кристалл токсина, прокрашивающийся красителем анилиновым чёрным (систематический признак) На мясо-пептонном агаре через 1 сутки инкубации образуются округлые серовато-белые колонии диаметром 3-5 мм со слабоволнистым краем, матовой мелкозернистой поверхностью, пастообразной консистенцией. Через 3-5 суток колонии становятся серыми, гладкими, появляется прозрачная кайма по краю [43]. Клетки и специфический кристаллический белковый δ-эндотоксин проявляют инсектицидное действие по отношению ко многим насекомым. Используется в биозащите растений, при помощи гена эндотоксина (Cry-токсина) осуществлена трансформация растений и получены генетически модифицированные растения, устойчивые к поеданию вредителями [42].

Bacillus licheniformis - грамположительные, одиночные подвижные палочки размером 0,6-0,8 и 0,2-0,3 мкм, спорообразующие.

На мясопептонном агаре (t 40^oC, 24 часа) штамм дает обильный рост; колонии неправильной формы с приподнятым центром, слизистые, гладкие, непрозрачные, 2-5 мм в диаметре с ровными краями, в начале роста - кремовые, затем - постепенно розовеющие [41].

На мясопептонном бульоне (t 40^oC, 24 часа) также наблюдается обильный рост клеток, раствор становится мутным, к 24 часам роста появляется кремово-розовый оттенок [42].

По отношению к кислороду - аэроб. Температурный диапазон роста - 18-45^oС. Оптимальная температура для роста - 40^oС. Растет при значениях рН среды 5,0 - 10,0 [41].

Желатин разжижает. Крахмал и казеин быстро гидролизует. Восстанавливает лакмусовое молоко. Нитраты восстанавливает до нитритов. Образует тирозиназу (каталазоположительный), образует сероводород. Вызывает гемолиз. Сбраживает с образованием кислоты арабинозу, ксилозу, фруктозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, раффинозу, маннозу, маннит, сорбит, глицерин, декстрин, гликоген без выделения газа, глюкозу ферментирует анаэробно, утилизирует лимонную кислоту [43].

Регулярный контакт с бактериями этого вида естественен для человека, поскольку они на всех этапах эволюции присутствовали в воде, почве, продуктах питания и др [40].