Факторы патогенности бактероидов

Факторы патогенности		Биологический эффект
Токсины	эндотоксин	общетоксическое действие
	лейкоцидин	повреждает лейкоциты
Ферменты	коллагеназа	разрушает коллагеновые волокна соединительной ткани - распространение гнойного процесса
	ДНК-аза, гепариназа	вызывают внутрисосудистые изменения из-за повышенной свертываемости крови
	фибринолизин	растворяет тромбы
	бета - лактамаза	разрушает бета-лактамные антибиотики
Поверхностные структуры клетки	пили	адгезия к субстрату
	капсула	защищает бактерии от фагоцитоза
Метаболиты	летучие и  жирные кислоты	угнетают хемотаксис и кислородозависимую цитотоксичность лейкоцитов

 

       В роду выделяют большое число видов.  У человека в норме и патологии чаще обитают B. fragilis и B. melaninogenes.  Последний вид отличается образованием на агаре с лаковой кровью колоний черного цвета. 

       B. ureolyticus выделен при инфекциях дыхательных и мочевых путей, из полости рта, кишечника, из крови после экстракции зубов. 

       B. gracilis выделен  из  десневых  карманов,  а  также в случаях анаэробной плевропульмональной инфекции.  

       В роду B.  также выделены виды B. buccae,   B. buccalis,  B. denticola,  B. forsythus,  B. heparinolyticus, B. intermedius, B. loeschei, B. oralis, B. oris, B. oulorum, B. pneumosintes,  B. veroralis, B. zoogleoformans и др.

       Являются представителями нормальной микрофлоры человека. Концентрация анаэробных микроорганизмов в десневых карманах, толстом кишечнике в 1000 раз превосходят популяцию аэробов, и их количество там достигает 10¹². В толстом кишечнике преобладают бактероиды: Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Bacteroides distasoni, реже встречаются  Bacteroides fragilis. Поэтому бактероиды вызывают анаэробные инфекции, локализующиеся ниже диафрагмы. В десневых карманах преобладают Porphyromonas spp., Prevotella spp., которые вызывают анаэробные инфекции с локализацией выше диафрагмы.    

В слюне, на языке, в желудке и тонком кишечнике соотношение аэробов и анаэробов составляет 1:1. В волосяных фолликулах, матке, влагалище преобладают неспорообразующие грамположительные анаэробные бактерии, их количество в этих биотопах превосходит аэробов в 5 – 100 раз.  

    

         

     Бактероидозы -- заболевания,  вызываемые бактероидами. Бактероиды в виде монокультуры или в ассоциациях с пептококками, фузобактериями,  энтеробактериями изолируют при сепсисе,  септикопиемии, абсцессах легких,  мозга,  таза,  брюшной полости, гангрене легких, гнойных плевритах, перитоните, аппендиците, цистите, отите, инфицированных ожоговых, травматических и операционных ранах. Гной часто имеет зловонный запах.  

       Микробиологическая диагностика состоит в посеве материала на кровяной агар и выращивании культуры в анаэробных условиях.  Роль в этиологии определяют исходя из критериев для условно-патогенных микробов.

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Методы культивирования анаэробов

• Для транспортировки анаэробов используют транспортные среды, предотвращающие токсическое действие кислорода (Amies, Cary&Blair, Stuart);

• Для культивирования используют высокопитательные среды, содержащие пептоны (1,5 – 2%), дрожжевой экстракт (0,5%), витамин К, гемин, редуцирующие вещества,  снижающие окислительные свойства среды (цистеин гидрохлорид, тиогликолят натрия); 

• Селективными добавками к средам являются антибиотики аминогликозидного ряда, к которым анаэробы природно устойчивы;

• Бескислородная атмосфера для культивирования анаэробов, создается в анаэростатах, анаэробных камерах, анаэробных пакетах.

Питательные среды для анаэробов:

•  Анаэробный кровяной агар с гентамицином или с канамицином и ванкомицином;

• Анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой;

• Желчно-эскулиновый агар для бактероидов; 

• Среда с гранулированным мясом, жидкая;

• Среда Китта-Тароцци 

• Тиогликолевая среда

Системы для создания и поддержания анаэробных условий

А. АНАЭРОБНАЯ КАМЕРА. Представляет собой герметичный прозрачный бокс, перчаточный или бесперчаточный. Анаэробные условия в нем достигаются созданием вакуума с последующим заполнением пространства камеры анаэробным газом (N2 (85%- 90%) + CO2 (5-10%) + Н2 - (5%)). Устройство оснащено шлюзом для подачи образцов из агрессивной кислород-содержащей среды, термостатом, устройством для поддержания и контроля влажности.

Б. МИКРОАНАЭРОСТАТ И ГАЗОГЕНИРИРУЮЩАЯ СИСТЕМА. Микроанаэростат – цилиндрическая герметично закрываемая металлическая или пластмассовая емкость объемом 2,5 (3 – 7) литров. Газогенерирующие системы генерируют Н2 и СО2. Водород связывает в присутствии палладиевого катализатора свободный кислород с образованием воды. Индикация анаэробных условий проводится  тест-полосками, которые обесцвечиваются в бескислородной атмосфере. 

В. АНАЭРОБНЫЕ ПАКЕТЫ. Представляют собой прозрачный, герметично закрываемый одноразовый пластиковый пакет, рассчитанный на несколько чашек Петри, анаэробные условия в котором создаются реакционной безводной анаэробной системой. 

       Bacteroides spp. растут на анаэробном кровяном агаре, образуя круглые, с ровными краями, блестящие, непигментированные колонии с зоной β -- гемолиза.

       Porphyromonas spp., Prevotella spp., Peptococcus spp. образуют  пигмент и их колонии  окрашиваются от светло-коричневого до черного цвета. Колонии Porphyromonas spp. растут мелкими и их размер увеличивается в присутствии Staphylococcus spp.  

       Колонии фузобактерий могут иметь светло лимонный цвет. 

       Использование молекулярных методов, например ПЦР 16 S рРНК генов, позволяет охарактеризовать сложные микробоценозы, такие как кишечный. Благодаря этому методу стало очевидным, что среди 400 видов кишечной микрофлоры,  лидирующие позиции занимают:

• Eubacterium biforme 

• Eubacterium limosum 

• Peptostreptococcus productus 

• Lactobacillus acidophilus 

• Clostridium clostridiiforme 

• Clostridium leptum 

• Clostridium. perfringens 

• Bacteroides thetaiotaomicron 

• Bacteroides vulgatus 

• Bacteroides distasonis 

• Escherichia coli 

Систематическое положение клебсиелл согласно классификации  Берджи, 2001			Klebsiella rhinoscleromatis (капсула), окраска  по Бурри-Гинсу
Домен	BACTERIA
Тип	PROTEOBACTERIA
Класс	GAMMAPROTEOBACTERIA
Порядок	ENTEROBACTERIALES
Семейство	Enterobacteriaceae
Род	Klebsiella
Вид	K.pneumoniae (подвиды: ozaenae, rhinoscleromae, pneumoniae), K.oxytoca, K.planticola, K.terrigena

       

       Клебсиеллы (Klebsiella) -- род палочковидных капсульных неподвижных аспорогенных грам- хемоорганотрофных факультативно-анаэробных   бактерий   из  семейства  Enterobacteriaceae. 

       У большинства штаммов есть постоянная  выраженная  капсула.  В окрашенных по Граму мазках клебсиеллы имеют вид прямых палочек размерами  0,5--0,81--5 мкм с закругленными концами.  В  тушевых препаратах форма бактерий эллипсоидная,  размеры 2--55--8 мкм.  

       Все виды хорошо растут на простых мясных средах в широком диапазоне температур.  Оптимальная температура  35--З6 °C, рН 7,0--7,4.  На плотных средах клебсиеллы  образуют гладкие, крупные, выпуклой  формы,  слизистой консистенции колонии.  В падающем свете они влажные,  блестящие,  серовато-белые, в проходящем -- гомогенно-мутные  с  перламутровым  оттенком.  В  бульоне дают диффузный рост.  В полужидком агаре растут на поверхности среды и в верхней части  укола.  Протеолитическая  активность клебсиелл  выражена в слабой степени -- сероводород, индол не образуют. Желатину и сыворотку не разжижают.  Гликолитическая активность выражена в разной степени. Тесты на ферментацию дульцита,  мочевины, утилизацию цитрата, малоната,  декарбоксилазы,  МР и ФП вариабельны. Растут на средах с цианистыми солями.  

       По специфичности О-Аг разделяют на  5  серогрупп,  K-Аг -- на 72 серовара. Для патологии человека имеют значение: K. ozaenae -- возбудитель озены, K. rhinoscleromatis -- возбудитель склеромы, K. pneumoniae  -- широко распространены в природе разнородны по своим свойствам и функциям. Размеры широко колеблются.  Капсула и слизистый рост выражены не у всех штаммов.  Многие штаммы имеют фимбрии. Используют цитраты в качестве единственного источника углерода.  Ферментируют большое число углеводов с выделением газа,  в т. ч.  лактозу, глюкозу, сахарозу, адонит, инозит, образуют лизиндекарбоксилазу,  гидролизуют мочевину; реакции с МР и ФП, ферментация дульцита вариабельны. Антигенная формула -- О1, О3, О4, О5:К1-КЗ, К7-К72. Обитают в воде, почве, в пищевых продуктах, в кишечнике и дыхательных путях человека,  др. млекопитающих, птиц. Условно-патогенны для человека.

       В 9-м издании "Определителя Берджи" клебсиеллы озены,  склеромы и пневмонии в ранге подвидов объединены  в  один вид  -- K. pneumoniae.  Кроме того,  выделено еще три новых вида -- K. oxytoca, K. planticola, K. terrigena.

     

       Клебсиеллезы -- заболевания, вызываемые бактериями рода Klebsiella,  разделяются на хронические клебсиллезы -  склерому   и озену  и острые и острохронические клебсиллезы, обусловленные K. pneumoniae и K. oxytoca.  Заболевания,  вызываемые K. pneumoniae, могут быть генерализованными (сепсис, септикопиемия) и локализованными. К последним относятся пневмонии и бронхиты,  госпитальные раневая и ожоговая инфекции,  пищевые токсикоинфекции, инфекции желчных и мочеполовых путей,  отиты,  перитониты и др.  клебсиллезы обычно протекают тяжелее,  чаще  переходят  н хроническую форму,  с большим трудом поддаются терапии,  чем аналогичные  заболевания  др.  этиологии. Этиологический  диагноз  устанавливают бактериологическим методом по той же схеме, что и при аналогичных заболеваниях энтеробактериальной природы,  с учетом критериев возбудителя для условно-патогенных микробов.

     Озена --  первично-хроническое инфекц. заболевание человека,  вызываемое Klebsilla ozaenae. Возбудитель озены  имеет вид грам- палочек с закругленными концами длиной 5--8 мкм,  толщиной 2--5 мкм (с капсулой),  располагается  одиночно  или  попарно. Постоянно содержит толстую капсулу, состоящую из кислых гетерополисахаридов.  Жгутиков, ресничек нет, спор не образует. 

       Хемоорганотроф,  факультативный анаэроб.  Хорошо растет на простых средах при  30--37 °С ,  рН 7--7,4,  формируя  крупные  выпуклые круглой  формы  с ровными краем и поверхностью слизистые колонии. Ферментирует глюкозу с выделением кислоты  или  кислоты  и  газа, маннит, мальтозу, адонит, инозит в 1-е сутки инкубации, лактозу и сахарозу часть штаммов ферментирует позднее.  Растет на средах с желчью и цианидами.  Тесты на ферментацию малоната, мочевины,  желатины, щелочение молока, образование индола и сероводорода, ФП отрицательны, тест с МР положителен. Часть штаммов синтезирует лизиндекарбоксилазу и утилизирует цитраты. Большинство штаммов имеет антигенную формулу 02В:К4, встречаются штаммы с формулой О2В:К5,  О2В:К6, редко - др. варианты. Клебсиелла озены является облигатным паразитом человека,  высокочувствительна к высыханию,  свету, температуре, антисептикам, дезинфектантам, аминогликозидам, тетрациклинам, левомицетину. Для клинически выраженной формы озены характерны тотальная атрофия слизистой оболочки носа, носоглотки и костных раковин; формирование корок в носу; снижение или утрата обоняния; зловонный запах из носа. Иногда заболевание может распространяться на гортань, трахею, бронхи. У больных в местах поражения постоянно находится возбудитель,  в сыворотке  крови  -  Ат против О-Аг.  Ат против капсулы не выявляются.

     Для микробиологической диагностики используют микроскопический,  бактериологический и серологический методы.  

       Материалом для исследования служит слизь из носа,  которую с соблюдением правил забирают ватным тампоном или бактериологической петлей в стерильную посуду. Материал сразу подвергают анализу или помещают в консервант (0,5 % стерильный р-р натрия хлорида с 0,1 % желатины и 5 ЕД/мл пенициллина, рН 7,4). Мазок из слизи  обрабатывают р-ром  Люголя  около 1 мин или окрашивают по Романовскому--Гимзе 30 мин. В положительных случаях в препарате видны толстые палочки с негативно оттененной капсулой.  

       Более чувствительным, специфичным и надежным способом является выделение культуры. С этой целью материал петлей или тампоном засевают на МПА или лактозобромтимоловый агар с 1--2 ЕД/мл пенициллина. На 2-й день из нескольких слизистых колоний делают мазки, окрашивают по Граму и Гинсу--Бурри. Если в мазках обнаруживают грам- капсульные бактерии, остатки колоний пересевают на среду Расселла с бромтимоловым синим или на скошенный МПА. Возбудитель озены разлагает лактозу,  но малоактивно и иногда медленно.  В связи с этим  колонии клебсиеллы  озены на лактозобромтимоловом агаре и скошенная часть среды Расселла на 2-й день их роста в большинстве случаев не  окрашиваются в желтый цвет в отличие от клебсиеллы пневмонии.  Чистую культуру идентифицируют, при затруднении в дифференциации возбудителя озены от возбудителя склеромы может быть применено заражение нескольких белых мышей или куриных эмбрионов дозой 5 млн/мл. Клебсиелла озены вызывает гибель всех или большинства животных, клебсиелла склеромы не вызывает их гибели.  

       При  наличии противокапсульных  сывороток проводят ускоренную идентификацию по характеру роста бактерии на лактозобромтимоловой среде, РА на стекле с  противокапсульными сыворотками (К4, К5, К6) и морфологии микроба. 

     Для серологической диагностики используют РСК с гретой культурой типового штамма плотностью 1 млрд/мл.  Реакцию ставят по стандартной методике в разведениях сыворотки  1:5--1:80.  

       За  диагностический  титр принимают  разведение  1:5 интенсивностью в +++. Поскольку РСК часто дает групповую реакцию с сывороткой больных склеромой, ее ставят одновременно с обоими (склеромным и озенозным) диагностикумами.  Предложена РПГА. Диагностический титр ее 1:160 и выше.  РА с капсульным Аг отрицательна,  с  бескапсульным мало специфична.

       Склерома -  первично-хроническое  инфекционное   заболевание верхних  дыхательных путей человека,  вызываемое K. scleromatis.  Возбудитель относится к роду Klebsiella семейства Enterobacteriacea.        Имеет вид прямой палочки с закругленными концами,  размеры 0,5--0,81--5 мкм. Во влажных негативных препаратах  выявляется  большая  капсула,  тело с капсулой эллипсоидной формы, размеры 2--55--8 мкм. Жгутиков и фимбрий не содержит, спор не образует, капсула является постоянной структурой.         Хемоорганотроф,  факультативный анаэроб.  Возбудитель склеромы хорошо растет на основных средах при рН 7--7,4,  30--37 °C,  формируя на плотных средах крупные выпуклые с ровными краями и поверхностью  выраженно  слизистые колонии, вызывая в бульоне диффузное помутнение со слизистым кольцом на поверхности,  давая в полужидком агаре рост в  начальной  части  укола.  Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу,  сахарозу (на 2--4-й день),  маннит, инозит, адонит и ряд др. углеводов.  Не ферментирует лактозу (при 5-дневной экспозиции),  дульцит. Тесты на МР, малонат, щелочение лакмусового молока,  рост на средах с цианидами положительны, на сероводород, индол, утилизацию цитратов, ферментацию мочевины, желатины и лизина, ФП  отрицательны. Рост культуры угнетается желчью (75 %) и желчными солями. 

       Антигенная формула - О2А:КЗ (О-Аг - 2А, капсульный - 3). О-Аг характеризуется выраженными антигенными связями с возбудителем озены,  К-Аг идентичен серовару К3 K. pneumoniae.  

       Обитает только у больных склеромой.  Может находиться в окружении больного (на посуде,  белье, поверхности). Заражение происходит опосредованным контактом и капельным путем.  

       Микробиологическую диагностику проводят бактериологическим и серологическим методами. Ориентировочные данные можно получить при микроскопии мазков из слизи, обработанных р-ром Люголя (обнаружение капсульных бактерий),  и цитологическом  исследовании из инфильтрата (обнаружение клеток Микулича). 

       Основным материалом для выделения культуры является содержимое носа и глотки,  которое при инфильтративной форме забирают бактериальной петлей прямо из инфильтрата, при атрофической и рубцовой формах - тампоном раздельно из обеих половин носовой полости и из носоглотки.  Материал засевают на МПА или лучше на лактозобромтимоловый агар (ЛБС) с 1-- 2 ЕД/мл бензилпенициллина. На 2-й день с 2--5 бесцветных слизистых колоний на ЛБА  делают  высев  на  среду Расселла с бромтимоловым синим. Возбудитель склеромы изменяет цвет столбика, не дает разрывов. Чистую культуру проверяют на ее отношение к окраске по Граму, присутствие капсулы (окраска по Гинсу--Бурри), слизистый рост, подвижность, ферментацию лактозы, сахарозы, глюкозы,  маннита,  адонита (инозита), мочевины, малоната, щелочение лакмусового молока,  реакции МР и ФП,  утилизацию цитрата.  

       В  случае затруднений  в дифференциации с возбудителем озены проводят РА на стекле с антисыворотками (К3, К4) и биопробу, для чего исследуемую культуру в  дозе 10 млн  вводят нескольким куриным эмбрионам в хорионаллантоисную полость или белым мышам внутрибрюшинно. В этой дозе возбудитель склеромы в  отличие  от  возбудителя озены гибели эмбрионов и мышей не вызывает.  

       При  ускоренной  идентификации  ограничиваются морфологией микроба, характером роста культуры на ЛБА и среде Расселла и агглютинацией ее K3-сывороткой.  В сыворотках подавляющего большинства больных всеми формами и на всех стадиях склеромы обнаруживают Ат против О-Аг.  Их выявляют в РСК (диагностический титр - 1:5  и  выше)  и РПГА  (диагностический  титр - 1:160 и выше).         Техника постановки РСК обычная.  Инактивированную сыворотку разводят,  начиная с 1:5 до 1:80, в качестве диагностикумов берут гретые суточные агаровые культуры типовых капсульных штаммов клебсиелл склеромы и  озены плотностью 500 млн/мл, общий объем реакции - 2,5 мл. РПГА проводят с сывороткой больного, разведенной от 1:80 до  1:640,  диагностикумы  - склеромный  и  озенозный - представляют собой сенсибилизированные О-Аг указанных бактерий нативные бараньи эритроциты. Объемы сыворотки и эритроцитов - по 0,25 мл.  Постановка и учет такие же, как при пробирочной РПГА с другими Аг. РА с бескапсульным вариантом мало специфична, с капсульным - отрицательна. 

Систематическое положение вибрионов согласно классификации  Берджи, 2001		V.cholerae, окраска  по Граму
Домен	BACTERIA
Тип	PROTEOBACTERIA
Класс	GAMMAPROTEOBACTERIA
Порядок	VIBRIONALES
Семейство	Vibrionaceae
Род	Vibrio
Вид	V.cholerae (биовары: cholerae, eltor), V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.sputorum и др.

 Медицинское значение имеет род Vibrio, включающий 55 видов, которые могут быть классифицированы в зависимости от вызываемых заболеваний: 

1. Вибрионы – возбудители холеры: V. cholerae 0₁ cholerae (классический, азиатский), выделенный Р. Кохом в Гонконге в 1883 г. от больного; V. cholerae 0₁ El-Tor, изолированный от мусульманских паломников в 1906 г. на карантинной станции Эль Тор в Египте, и V. cholerae 0₁₃₉ Вengal, который был обнаружен в 1993 г. в индийском штате Западная Бенгалия у больных во время крупной вспышки диарейной холероподобной инфекции.

2. Вибрионы – возбудители гастроэнтеритов: V parahaemolyticus, V. cholerae, не относящиеся к серогруппе O1, V. fluvialis, V. mimicus, V.  furnissii, V.  hollisae, V.  alginolyticus, V vulnificus.

3. Вибрионы – возбудители раневых инфекций. V alginolyticus, V vulnificus, V. cholerae, не относящиеся к серогруппе O1, V.  damsela, V.  carchariae, V fluvialis, V parahaemolyticus, V mimicus. 

4. Вибрионы – возбудители септицемии. V vulnificus, V fluvialis, V damsela, V. cholerae, не относящиеся к серогруппе O1, Vibrio cincinnatiensis.

       Морфология.

Холерные вибрионы - грамотрицательные полиморфные слегка изогнутые или прямые палочки (имеют вид полумесяца, запятой или ¼ окружности). Благодаря их форме и первооткрывателю, их называют «запятой Коха» (рис.1). Холерные вибрионы спор и капсул не образуют. Обладают выраженной подвижностью, так как имеют один полярно расположенный жгутик (монотрихи), который в 2—3 раза длиннее тела клетки. 

 

Рис. 1.  Вибрионы холеры

Культуральные свойства.

Холерные вибрионы — факультативные анаэробы с более выраженными аэробными свойствами. Неприхотливы. Хорошо растут на простых питательных средах (МПА, МПБ). Мезофиллы: температура культивирования 37-39 °С.  

На поверхности пептонной воды рост холерного вибриона проявляется уже через 6—8 ч в виде нежной пленки, на щелочном агаре через 12—14 ч образуются полупрозрачные голубоватые колонии, как капельки утренней  росы, диаметром 1—2 мм. 

В качестве дифференциальной среды используется ТСBS-агар, который содержит: Т-тиосульфит, С-цитрат, В –соли желчных кислот, S – сахарозу, а также индикатор рН – бромтимоловый синий. ТСBS-агар имеет сине-зеленый цвет. V. сholerae разлагают сахарозу и образующиеся кислоты приводят к изменения цвета индикатора рН на желтый. Поэтому V. cholerae на этой среде образуют колонии с желтым ореолом (рис.2).  

Рис. 2. Рост Vibrio cholerae на среде  ТСBS

       Биохимические характеристики холерных вибрионов.

       Холерные вибрионы расщепляют сахара с образованием кислоты без газа. Ферментируют глюкозу, сахарозу, маннозу, манит;  не ферментируют  арабинозу, лактозу и инозит. 

       Триада Хёйберга (манноза+; сахароза+; арабиноза-) имеет диагностическое значение. По способности разлагать эти три углевода все вибрионы холеры разделяют на 6 групп. Холерные вибрионы разлагают только маннозу и сахарозу и принадлежат к 1-й группе Хейберга.  

       Для полной идентификации V. сholerae изучают и другие их биохимической свойства. V. сholeraeразжижают желатину, образуют индол из триптофана, продуцируют оксидазу, восстанавливают нитраты в нитриты, сероводород не образуют. Обладают диастатической активностью (расщепляют крахмал)? плазмокоагулирующими (свёртывают плазму кролика) и фибринолитическими (разжижают свёрнутую сыворотку) свойствами. Биовары Vibrio cholerae cholerae и el-tor имеют рад различий, которые позволяют их дифференцировать. 

 

Биовары V.cholerae.

На основании ряда свойств V.cholerae O1  подразделяются на 2 биологических варианта – классический (син. азиатский) и El-Tor. Эти биовары отличаются способностью агглютинировать эритроциты кур, чувствительностью к полимиксину В (50 ЕД/мл), реакцией Фогеса — Проскауэра (способность образовывать ацетилметилкарбинол), чувствительностью к диагностическим холерным  бактериофагам — классическому и эльтор (табл.1).

                                                                                                                               Таблица 1