Специфичность действия амилазы и сахаразы

Принцип метода. Специфичностью называется способность ферментов ускорять отдельные химические реакции только между строго определенными веществами. Результат действия ферментов амилазы и сахаразы на субстраты крахмал и сахарозу оценивается с помощью качественной реакции Фелинга. Крахмал и сахароза не имеют свободных полуацетальных гидроксилов и поэтому не восстанавливают Cu⁺² сульфата меди (реактив Фелинга I), которые придают раствору голубую окраску, до Сu₂О (осадок кирпично-красного цвета), то есть дают отрицательную реакцию Фелинга, а продукты расщепления крахмала и сахарозы (мальтоза и глюкоза) имеют свободные полуацетальные гидроксилы и дают положительную реакцию Фелинга.

Реактивы:

1. 1 % раствор крахмала;

2. 2 % раствор сахарозы;

3. слюна 1:10;

4. сахараза из дрожжей;

5. 10 % NaOH;

6. раствор Люголя.

Ход работы.

Берут 4 пробирки и вносят реактивы по следующей схеме.

1 пробирка - 2 мл сахарозы и 0.5 мл разведенной слюны;

2 пробирка - 2 мл сахарозы и 0.5 мл сахаразы;

3 пробирка - 2 мл крахмала и 0.5 мл разведенного слюны;

4 пробирка - 2 мл крахмала и 0.5 мл сахаразы.

Содержимое пробирок хорошо перемешивают и ставят на 10 минут в термостат (37°С). После инкубации во все пробирки добавляют по 5 капель реактива Фелинга I, по 5 капель реактива Фелинга II и ставят в кипящую баню на 2 минуты. Отмечают изменения окраски.

Результат:

Пробирка № 1_____________________________________________________

Пробирка № 2_____________________________________________________

Пробирка № 3_____________________________________________________

Пробирка № 4_____________________________________________________

Вывод: _____________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа № 6 Регуляция активности ферментов Изучение аллостерических свойств а-амилазы

Принцип метода. Некоторые лекарственные препараты и хлориды металлов могут оказывать аллостерическое влияние на активность амилазы. Активность амилаза определяется фотометрически по уменьшению количества крахмала в ходе его гидролиза под действием амилазы. Крахмал выявляется в цветной реакции с йодом. Для создания среды, оптимальной для работы фермента, используется фосфатный буфер рН 7,2.

Ход работы.

1). Приготовление раствора амилазы. Собирают в пробирку 0.5 мл не разведенной слюны, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой и тщательно перемешивают содержимое пробирки.

2). Приготовление раствора лекарственного препарата. Таблетку растирают в ступке, порошок растворяют в буфере и количественно переносят в мерную колбу объемом 100 мл, объем жидкости доводят до метки буфером.

3). Инкубация амилазы с лекарственным препаратом: берут 2 стаканчика и смешивают растворы:

1 стаканчик - 1 мл амилазы в 1 мл буфера;

2 стаканчик - 1 мл амилазы и 1 мл раствора лекарственного препарата.

Инкубируют 15 минут при 37°С (термостат).

4). Определение активности амилазы. Берут 3 пробирки и вносят следующие растворы:

1 пробирка - 0,05 мл из стаканчика №1;

2 пробирка - 0,05 мл из стаканчика №2;

3 пробирка - 0,05 мл буфера.

Во все пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала, хорошо перемешивают и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут. После инкубации в каждую пробирку вносят 1 мл раствора йода и 8 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешивают и немедленно измеряют светопоглощение против дистиллированной воды на фотоэлектроколориметре, светофильтр №8, кювета с толщиной слоя 1 см. Записывают величину экстинкции для каждой пробирки (Е₁,Е₂,Е₃).

5). Расчет активности амилазы. Активность амилазы выражают в граммах крахмала, расщепленного 1 литром слюны за 1 час инкубации при 37°С. активность амилазы без лекарственного вещества – А₁:

А₁=(Е₃-Е₁)/Е3*80 г/(л*час)

Активность амилазы в присутствии лекарственного вещества - А₂:

А₂=(Е₃-Е₂)/Е3*80 г/(л*час)

Сравнивая величины А₁ и А₃, можно сделать вывод о наличии аллостерических влияний на активность амилазы и их направленности.

Результат: ___________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Е1=_________________________

Е2=_________________________

Е3=_________________________

А1=_________________________

А2=_________________________

Вывод_______________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________