Графическое определение константы Михаэлиса (Кm)

Графически константа Михаэлиса может быть представлена, как это показано на рис. 6.1. Однако в случае многих ферментов определение V_max и К_m непосредственно из графика зависимости V_о от [S] (рис. 6.1) оказывается затруднено. Для большего удобства уравнение Михаэлиса–Ментен было преобразовано Лайнуивером и Берком в координатах двойных обратных величин:

Правую часть уравнения представляют в виде суммы двух слагаемых:

Упростив уравнение, получаем:

Как можно видеть, это уравнение представляет собой уравнение прямой:

у = ах + b,

где у = 1/V_о и х = 1/[S].

Если построить график зависимости у (т.е. 1/V_о) от х (т.е. 1/[S]), то длина отрезка b, отсекаемого на оси у, будет равна 1/V_max, а тангенс угла наклона – а равен величине K_m/V_max. Длину отрезка, отсекаемого на оси х (в области отрицательных значений), можно получить, приравняв к нулю. Тогда получим:

График уравнения Михаэлиса–Ментен в обрат­ных координатах называют графиком Лайнуивера–Берка (рис. 6.3). Используя его, величину K_m можно определить либо по наклону прямой и длине отрезка, отсекае­мого на оси у, либо по длине отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений на оси х. Поско­льку [S] измеряют в молях/литр, K_m имеет ту же размерность. Скорость V_о мо­жет быть выражена в любых единицах, поскольку K_m не зависит от [E]. График Лайнуивера–Берка позволяет определять K_m по отно­сительно небольшому числу точек, поэтому он часто используется для расчета этого параметра.

Рис. 6.3 График Лайнуивера–Берка в двойных обратных координатах (зависимость 1/V_о от 1/[S]), используемый для графического определения K_m и V_max.

Используя график Лайнуивера–Берка на прак­тике, при определении K_m, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких кон­центраций субстрата. Это происходит в тех случаях, когда измерения проводят через равные интервалы [S]. Чтобы этого избежать, измерения следует прово­дить при таких значениях [S], которые соответ­ствуют равным интервалам на оси х в обратных ве­личинах.

Определение K_m имеет большую практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих K_m, фермент будет работать практически с макси­мальной скоростью, поэтому максимальная скорость, V_max, будет отражать количество присутствующе­го активного фермента. Это немаловажное обстояте­льство используют для оценки содержания фермен­та в препарате. Знание величины K_m позволяет определить, какое количество субстрата следует внести в реакционную смесь для определения V_max. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое примене­ние при анализе характера действия ингибиторов на ферментативные реакции.

Ингибирование активности ферментов

Два основных класса ингибиторов фер­ментов представлены конкурентными и неконку­рентными ингибиторами. Их различают на основании способности ослаблять (конку­рентные ингибиторы) или не ослаблять (некон­курентные ингибиторы) свое ингибирующее дей­ствие при повышении концентрации субстрата. В действительности многие ингибиторы не проявляют тех свойств, которые характеризуют истинно конкурент­ное или чисто неконкурентное ингибирование. Другой принцип классификации ингибиторов основан на установлении мест их связывания в молекуле фермента. Одни из них взаимодействуют с ферментом в субстратном (каталитическом) центре, а другие - на значительном расстоянии от активного центра (например, в сайте аллостерической регуляции).