Сравнительное действие ферментов и катализаторов неорганической природы

Для сравнения скорости и эффективности катализа с участием специфических ферментов и катализаторов неорганической природы удобной моделью является процесс гидролитического расщепления крахмала под действием фермента слюны - амилазы или в присутствии кипящей разбавленной соляной кислоты. Глубину гидролиза крахмала определяют с помощью раствора Люголя (характерная реакция на присутствие остаточного количества полисахарида) и раствора сульфата меди (характерная реакция на присутствие моносахарида – глюкозы).

Реакция на полисахариды с раствором Люголя. В основе взаимодействия полисахаридов с йодом лежат процессы комплексообразования, адсорбции и др. Характер окрашивания зависит от строения полисахарида, в частности, от степени его ветвления. Развивающееся темно-синее окрашивание свидетельствует о присутствии крахмала, красно-бурое – гликогена или эритродекстрина. Заметим, что для идентификации двух последних соединений исследуемый раствор требуется прогреть: - в растворе, содержащем гликоген, кроме окрашивания наблюдается опалесценция, раствор, содержащий эритродекстрин остается прозрачным.

Реакция Троммера на моносахариды. В щелочной среде моносахариды и дисахариды, имеющие свободную карбонильную группу или свободную гликозидную (полуацетальную) гидроксильную группу, окисляются, одновременно восстанавливая металлы (медь, висмут, серебро).

Реакция основана на том, что в результате взаимодействия NaOH с CuSO₄ образуется гидроксид меди [II], имеющий синюю окраску. В присутствии восстанавливающих сахаров гидроксид меди [II] сначала переходит в гидроксид меди [I], который имеет желтую окраску, а затем в оксид меди [I] - Cu₂O. При этом развивается красное окрашивание.

Контрольные вопросы

1. Ферменты, их отличие от других катализаторов, значение и свойства

2. Классификация ферментов

3. Коферменты, их роль в катализе реакций

4. Специфичность ферментов

5. Изоферменты

6. Сравнение эффективности катализа с участием ферментов и катализаторов неорганической природы. Кислотный и ферментативный гидролиз крахмала

Литература

1. Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, т. 1, «Мир», М., 1982

2. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993

3. Горячковский А.М., Справочное пособие по клинической биохимии, ОКФА, Одесса, 1994

4. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996

5. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998

6. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000

Ход работы

Тема: Сравнение гидролитической активности амилазы слюны и раствора соляной кислоты

Определение эффективности катализа с участием ферментов и катализаторов неорганической природы

1. В три пробирки вносят по 5 мл 1%-ого раствора крахмала.

2. В первую пробирку (№1) добавляют 1 мл дистиллированной воды, во вторую (№2) – 1 мл 10% раствора HCl, а в третью (№3) – 1мл препарата амилазы слюны (приготовление препарата фермента указано ниже).

3. Пробирку №2 помещают в кипящую водяную баню, а пробирки №1 и №3 после перемешивания в термостат на 37°С.

4. После инкубирования в течение 20 минут все пробирки охлаждают и из каждой отбирают аликвоты для определения содержания крахмала по реакции с раствором Люголя, и глюкозы - по реакции Троммера.

5. Делают заключение о степени гидролиза крахмала в каждой из пробирок.

6. Сравнивают гидролитическую активность амилазы слюны и раствора соляной кислоты.

Приготовление разбавленного раствора амилазы слюны

1. Предварительно рот ополаскивают дистиллированной водой.

2. Затем в рот набирают приблизительно 20-25 мл дистиллированной воды и выдерживают ее в течение 5 минут.

3. Далее раствор собирают и фильтруют.

Проба на содержание крахмала (с раствором Люголя)

1. На предметное стекло наносят по капле раствора из каждой пробирки.

2. Каждую из капель смешивают с каплей раствора Люголя.

3. По интенсивности окраски делают выводы о наличии и количестве крахмала в каждой из проб.

Проба на наличие в среде глюкозы (проба Троммера)

1. Для определения содержания глюкозы из каждой пробирки отбирают по 3 мл раствора.

2. Добавляют по 1 мл 10% раствора NaOH и по 5 капель 1% раствора CuSO₄.

3. Пробирки нагревают до появления окраски.

4. Делают выводы о присутствии глюкозы в каждой из проб.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Описать результаты и занести их в таблицу:

№ пробирки	Субстрат	Катализатор	После инкубации
			Проба с раствором Люголя	Проба Троммера
1.	Крахмал	—
2.	Крахмал	Соляная кислота
3.	Крахмал	Амилаза слюны

4. Сделать выводы.

Методические указания к лабораторному практикуму по курсу

"Общая и экологическая биохимия"

Раздел "Ферменты"

Лабораторная работа № 5

Тема:	Количественный анализ каталитической активности ферментов. Анализ амилолитической активности амилазы слюны
Цель работы:	Ознакомление студентов с принципами выражения каталити-ческой активности ферментов: единицы активности ферментов Определение каталитической активности амилазы Изучение влияния физических и химических факторов на активность ферментов

Оборудование и материалы:

• Спектрофотометр SOLAR

• Кюветы стеклянные

• Термостат

• Плитка электрическая

• Пробирки

• Штативы для пробирок

• Колбы на 100-250мл

• Стакан на 300 мл

• Автоматические микропипетки

• палочки стеклянные

Реактивы:

• Крахмал, 0.25% раствор

• Сахароза, 2% раствор

• Фосфатно-цитратные буфера: рН 4.0, рН 5.4, рН 6.8, рН 8.0

• Фосфатный буфер, рН 6.8

• Гидроксид натрия (NaOH), 10% раствор

• Сульфат меди (CuSO₄), 1% раствор

• Раствор Люголя (1% раствор йода в 2,5% растворе KJ)

• Вода дистиллированная

Теоретическая часть