1. Бактериальная амилаза

Определение кинетических параметров, K_m и V_max, реакции гидролиза крахмала под действием бактериальной амилазы

1. В 5 пробирок вносят по 1 мл препарата амилазы слюны. Затем в каждую добавляют по 1 мл воды.

2. Пробирки инкубируют в термостате при 38°С в течение 1 мин.

3. Последовательно, точно отметив начальное время реакции, в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала в концентрации, указанной в таблице:

№ пробирки	1	2	3	4	5
Концентрация крахмала, мМ	2	1	0,5	0,25	0,125

4. В каждую пробирку добавляют 200 мкл раствора I₂ в KI (реактива Люголя). Пробы инкубируют в течение 10 мин.

5. Определяют оптическую плотность при =620 нм. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:

№ пробирки	Концентрация крахмала, мМ	А620
1	2
2	1
3	0,5
4	0,25
5	0,125

6. Строят график зависимости V_отн от S. По графику Лайнуивера-Бэрка определяют значение К_m

Влияние активаторов и ингибиторов на кинетические параметры бактериальной амилазы

1. В 10 пробирок вносят по 1 мл раствора фермента.

2. В первые 5 пробирок (серия № 1) добавляют по 1 мл 1 % раствора NaCl, в оставшиеся (серия № 2) - по 1 мл 2 % раствора CuSO₄.

3. Пробирки инкубируют в термостате при 38°С в течение 1 мин.

4. Добавление 1 мл субстрата в указанной в таблице концентрации (см. предыдущее задание) проводят попарно в каждую серию пробирок, например, через 2 мин.

5. В каждую пробирку добавляют 200 мкл раствора I₂ в KI. Пробы инкубируют в течение 10 мин.

6. Проводят фотометрирование образцов при =620 нм. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:

№ пробирки	А620
	Серия №1 (без ингибитора)	Серия №2 (с ингибитором)
1
2
3
4
5

7. Строят график зависимости V_отн от S для первой (с NaCl) и второй (с СuSO₄) серий проб. Рассчитывают K_m и V_max для скорости реакции расщепления крахмала в отсутствии и присутствии ингибитора, пользуясь графиком Лайнуивера-Берка.