Д ля реакции, которая протекает в такой стехиометрии, когда на образование продукта затрачивается одна молекула вещества а и две молекулы вещества в:

выражение для скорости реакции имеет вид:

скорость реакции ~ [А][В][В],

или

скорость реакции ~ [А][В]².

В самом общем случае, когда n молекул вещества А реагирует с m молекулами вещества В:

выражение для скорости реакции принимает вид:

скорость реакции ~ [А]ⁿ[В]^m.

Концентрация фермента

В определен­ных условиях скорость ферментативной реакции пря­мо пропорциональна количеству фермента. Однако это утверждение не всегда бывает верным, что можно показать на примере реакции, протекающей в условиях равновесия. Даже если известно, что прямая реакция действительно идет, кажется, что ее скорость равна нулю, поскольку с такой же скоро­стью идет и обратная реакция. В самом же начале фермента­тивной реакции, когда продукт еще практически отсутствует, обратная реакция идти не может. Кроме того, на начальной стадии реакции концентрация субстрата практически соответствует его исходному коли­честву. Поэтому скорость реакции в начальные промежутки времени, т.е. начальная скорость, будет прямо пропорциональна концентрации фермента.

Контрольные вопросы

1. Механизм каталитического действия ферментов

2. Модели фермент-субстратного взаимодействия

3. Количественные характеристики ферментативной активности. Единицы активности ферментов

4. Факторы, влияющие на активность ферментов.

Литература

1. Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, т. 1, «Мир», М., 1982

2. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993

3. Горячковский А.М., Справочное пособие по клинической биохимии, ОКФА, Одесса, 1994

4. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996

5. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998

6. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000

Ход работы

Тема: Анализ амилолитической активности амилазы слюны

Зависимость скорости ферментативной реакции от количества фермента

1. В четыре пробирки вносят по 1 мл фосфат-цитратной буферной смеси рН 6.8 и по 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала. В первую пробирку добавляют 1 мл препарата амилазы слюны, разведенного в 20 раз, во вторую - 1 мл препарата амилазы, разведенного в 40 раз, в третью - 1 мл препарата, разведенного в 80 раз, в четвертую – 1 мл препарата фермента, разведенного в 160 раз.

Примечание. Процедура получения ферментного препарата амилазы слюны описана в Лабораторной работе №4. В каждую последующую пробирку добавление ферментного препарата осуществляют строго по секундомеру через 3 минуты.

2. Пробирки немедленно помещают в термостат. Каждую пробу инкубируют при температуре 38-40°С в течение 10 мин.

3. Затем через каждые 3 минуты по секундомеру добавляют в пробирки по несколько капель раствора I₂ и определяют оптическую плотность растворов при  = 620 нм.

4. Результаты опыта представляют графически, откладывая по оси абсцисс относительную концентрацию амилазы, а по оси ординат значения относительной оптической плотности раствора при  = 620 нм.

Определение оптимального значения рН среды для активности амилазы слюны

1. В четыре пробирки вносят по 1 мл фосфат-цитратной буферной смеси с определенным рН по схеме, указанной в таблице:

№ пробирки	1	2	3	4
рН буфера	4.0	5.4	6.8	8.0

2. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала и по 1 мл разведенного препарата амилазы слюны.

3. Каждую пробирку помещают в термостат и инкубируют при температуре 38°С в течение 10 мин.

4. Затем в каждую пробирку быстро добавляют по несколько капель раствора I₂ и спектрофотометрически определяют оптическую плотность растворов при  = 620 нм.

5. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:

№ пробирки	рН буфера	А620
1	4.0
2	5.4
3	6.8
4	8.0

Зависимость скорости ферментативного гидролиза крахмала амилазой слюны от температуры.

1. В четыре пробирки вносят по 1мл фосфатного буфера рН 6.8 и по 1 мл 0.25%-ного раствора крахмала.

2. Пробирку №1 помещают в ледяную баню, пробирку №2 оставляют при комнатной температуре, пробирку №3 помещают в термостат при 38°С и пробирку №4 - в сильно кипящую водяную баню. В каждую пробирку добавляют по 1 мл разведенного препарата амилазы слюны и тщательно перемешивают содержимое. Каждую пробу инкубируют в течение 10 мин.

3. Затем в пробирки добавляют по несколько капель раствора I₂ и определяют оптическую плотность растворов при  = 620 нм.

4. Полученные результаты вносят в таблицу.

№ пробирки	Температура среды	А620
1	Низкая
2	Комнатная
3	380С
4	1000С

Специфичность действия амилазы.

1. В одну пробирку вносят 2 мл 0.25%-ного раствора крахмала, во вторую - 2 мл 2%-ного раствора сахарозы. Затем в пробирки добавляют по 1 мл разведенного препарата амилазы слюны и перемешивают содержимое.

2. После инкубации в термостате при температуре 38-40°С в течение 10 мин пробирки охлаждают и определяют в них содержание глюкозы по реакции Троммера.

3. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:

№ пробирки	Субстрат	Проба Троммера
	Крахмал
	Сахароза

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические материалы по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Оформить результаты в виде графика и таблиц.

4. Сделать выводы по каждому из опытов.

Методические указания к лабораторному практикуму по курсу

"Общая и экологическая биохимия"

Раздел "Ферментативная кинетика"

Лабораторная работа № 6

Тема:	Кинетика ферментативных реакций Регуляция активности ферментов
Цель работы:	Овладение методами кинетики ферментативных реакций: расчет значений констант Михаэлиса и максимальных скоростей реакций методом двойных обратных величин Изучение характера ингибирующего действия ацетилхолина на реакцию гидролиза ацетилтиохолина под действием ацетилхолинэстеразы

Оборудование и материалы:

• Спектрофотометр SOLAR

• Кюветы стеклянные

• Термостат

• Пробирки

• Штативы для пробирок

• Колбы на 100-250мл

• Стакан на 300 мл

• Автоматические микропипетки

• палочки стеклянные

• Бумага миллиметровая

Реактивы:

• Амилаза бактериальная

• Крахмал, 0.25% раствор

• Раствор Люголя (йод, 1% раствор в KJ, 2,5%)

• Сульфат меди (CuSO₄), 2% раствор

• Хлорид натрия (NaCl), 1% раствор

• Натрий-фосфатный буфер, 0,1 М рН 7,40

• Мембраны эритроцитов

• Ацетилтиохолин, 1мМ раствор в натрий-фосфатном буфере

• Ацетилхолин, 5мМ раствор в натрий-фосфатном буфере

• Реактив Эллмана

• Вода дистиллированная

Теоретическая часть