3.2 Определение количества белка

Для определения количества белка в исследуемом образце к 1 мл исследуемого раствора приливают 8 мл биуретового реактива. Оставляют на 30 мин при комнатной температуре и фотометрируют в кюветах при 540 им против контроля.

4 Оформление результатов работы

По калибровочному графику (график зависимости оптической плотности раствора от концентрации белка в нем), представленному на рисунке 1, определяют содержание бел­ка в пробе.

Рисунок 1 – Калибровочная кривая по белку

2. Физико-химические свойства белков

Белки – высокомолекулярные соединения (их молекуляр­ный вес колеблется от нескольких тысяч до десятков миллио­нов). Большинство белков обладает гидрофильными свой­ствами. Коллоидные растворы белка достаточно устойчивы. Такая стабильность белковых растворов обусловлена двумя основ­ными факторами: во-первых, белковая частица несет элек­трический заряд, и, во-вторых, вокруг белковой молекулы образуется плотная водная оболочка, состоящая из несколь­ких слоев, что препятствует объединению белковых молекул и выпадению их в осадок.

Для осаждения белка нужно лишить его факторов, удер­живающих его в растворе, используя различные агенты, сни­жающие заряд или разрушающие гидратную оболочку бел­ковой молекулы.

Реакции осаждения белков весьма разнообразны, однако их можно разделить на две группы:

1. Практически необратимые реакции осаждения, при которых белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе. В этом случае наступает денатурация белка. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями, тяжелых ме­таллов, алкалоидными реактивами, минеральными и органи­ческими кислотами, а также осаждение при нагревании.

2. Обратимые реакции осаждения, при которых осаждае­мые белки не подвергаются глубоким изменениям, и поэтому, получаемые осадки белков могут быть растворены в перво­начальном растворителе. Молекула белка при этом сохра­няет свои первоначальные нативные, включая биологические, свойства и не подвергаются заметной денатурации. К обра­тимым реакциям осаждения следует отнести осаждение бел­ков органическими растворителями (спиртом или ацетоном), высаливание белков, осаждение под влиянием концентрированных растворов нейтральных солей NH₄Cl, NaCl, (NH₄)₂SO₄ и др.

2.1 Лабораторная работа 12. Осаждение белков солями щелочных и щелочноземельных металлов

Добавление нейтральных солей аммония, солей щелочных в щелочноземельных металлов Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄, NaCl и др. к растворам белков вызывает разрушение гидратной оболочки белковых молекул и снятие заряда, что приво­дит к выпадению белка в осадок. Такой способ осаждения белков называют высаливанием. Высаливание - обратимый процесс. Осажденный белок можно вновь растворить в воде, при этом наблюдается восстановление нативных свойств белка (например, ферментативной активности, антигенных свойств и др.). Метод высаливания используют для разделения белковых фракций, очистки белков я получения их в кристаллическом состоянии.

1 Цель работы – провести высаливание белка солями щелочных и щелочноземельных металлов

2 Приборы и материалы

Белок 1 %

Сернокислый аммоний (измельченный порошок)

3 Описание работы

В пробирку наливают 20 капель раствора белка и при­бавляют тонко измельченный порошок сернокислого аммония до полного насыщения раствора, т.е. до тех пор, пока новая порция порошка останется нерастворенной. Через не­сколько минут появляется осадок.

4 Оформление результатов работы

Используя ответы на контрольные вопросы, сформулируйте выводы по данной работе.

5 Контрольные вопросы

1. На чем основан метод высаливания белков?

2. Какие агенты используют для высаливания белков?