3.4.3.Клеточные и молекулярные механизмы обучения и памяти
Широкое вовлечение корково-подкорковых структур в механизмы замыкания ассоциативной связи, формирования энграммы основано, с одной стороны, на явлении иррадиации раздражительного процесса по специфическим и неспецифическим системам мозга, а с другой — на достоверно установленных фактах конвергенции разномодальных импульсов на одном нейроне. Впервые гипотеза конвергентного принципа замыкания ассоциативной связи была сформулирована Дж. Экклсом в 1968 г. Он предположил существование «центра» конвергенции, не имеющего определенной локализации. На нейронах, входящих в состав этого «центра», происходит встреча сочетаемых раздражителей. По принципу конвергенции гетерогенных стимулов на таком нейроне происходит формирование пространственно-временной структуры. Гипотеза Дж. Экклса получила дальнейшее развитие и была дополнена представлениями о следовых процессах и их роли в формировании и фиксации энграммы. Основу формирования памятного следа составили феномен реверберации импульсной активности по замкнутым нейронным цепям и явление длительной синаптической (посттетанической) потенциации, хорошо изученное в нейрофизиологии.
Принцип конвергенции стимулов гетерогенной модальности получил основательное развитие в теоретической концепции П. К. Анохина о конвергентном замыкании ассоциативных связей. Имеющие место при образовании ассоциативной связи нейрофизиологические процессы проторения, суммации, посттетанической потенциации, взаимодействие сигналов различных сенсорных модальностей и биологических модальностей, по мнению П.К. Анохина, являются недостаточными для объяснения длительности явлений фиксации нервных связей на синаптическом уровне. Эти процессы являются необходимыми только для проведения нервных импульсов из разных структур мозга к тем пунктам, которые обеспечивают реальную фиксацию энграммы. К ним относятся, по гипотезе П.К. Анохина, прежде всего молекулярные преобразования в пределах мембраны и цитоплазмы постсинаптического нейрона. Особые свойства подкрепляющего фактора определяются специфическими химическими реакциями, которые он вызывает. Химически гетерогенная чувствительность мембраны клетки обеспечивает ей «различение» эффективных (подкрепляемых) и неэффективных (неподкрепляемых) синаптических входов Именно в пределах мембраны и цитоплазмы нейрона происходит ассоциация эффектов условной и безусловной стимуляции с последующим выходом сложившейся интеграции на аксон в виде импульсного разряда клетки. Именно химическая гетерогенность мембраны клетки является отправным пунктом для запуска цепей биохимических процессов в цитоплазме нейрона. Начальная цепь ферментативных процессов приводит к изменению кодов на молекуле рибонуклеиновой кислоты и к фиксации новой констелляции в белковой молекуле. Таким образом, местом «сцепления» сочетаемых стимулов оказываются конкретные нейроны, а действие механизма ограничивается их мембраной и цитоплазмой.
В настоящее время исследования ведутся по пути двух основных гипотез механизмов обучения — синаптической, предполагающей участие синаптических соединений в формировании феноменов пластичности, и мембранной, включающей постсинаптическую локализацию следового процесса (от изменений свойств возбудимой постсинаптической мембраны до цитоплазматических белковых изменений нейрона).
Синаптическая гипотеза давно привлекает внимание исследователей. Неоднократно высказывались предположения, что в основе обучения могут лежать не только механизмы изменения эффективности имеющихся межклеточных связей, но и проторение новых связей и контактов [13]. Эффективность синаптической передачи оценивается по величине возбуждающего постсинаптического потенциала (ВПСП), генерируемого в ответ на одиночное электрическое раздражение волокна (группы волокон), образующего исследуемый синапс (группу синапсов). В зависимости от условий, вызывающих изменения синаптической эффективности, выделяют несколько типов модифицирующихся или «обучающихся» синапсов (рис. 23). Простейшей формой пластичности межнейронных связей является синапс Экклса (см. рис. 23, А), повышающий свою эффективность по мере «упражнения» в результате развития посттетанической потенциации. Для объяснения явления привыкания, угашения реакций Г. Хорном в 1969 г. выдвинуто предположение о существовании синапсов, постепенно снижающих свою проводимость, «привыкающих» синапсов. Механизмом формирования условного рефлекса, требующего сочетания двух раздражителей, по Ю. Конорскому, служит модель усиления синаптической эффективности, условием которой является совпадение активации пресинаптического пути (терминали) с активацией подкрепляющего пути, при этом сигналы подкрепления могут передаваться с помощью
Рис. 23. Основные виды гипотетических модифицирующихся синапсов.
А — активация синапса (Дж. Экклс, 1953), Б—активация синапса и подкрепляющей системы (Ю.Конорский, 1948), В — активация синапса и постсинаптического нейрона (Д. Хебб, 1949), Г — активация синапса, подкрепляющей системы и постсинаптического нейрона (Дж. Гриф фит, 1966)
синапсов, оказывающих пресинаптическое облегчение (рис. 23, Б). С 1949 г. широкую известность получила гипотеза Д.О. Хебба, постулирующая в качестве условия синаптической модификации совпадение пресинаптической активности с разрядом постсинаптического нейрона (рис. 23, В), причем такое совпадение может приводить как к росту эффективности синапса, так и к ее снижению. Однако эксперименты показали, что процесс обучения, развивающийся по механизму простой ассоциации в виде пре- и постсинаптической активации, требует значительного числа применений. Например, при сочетании периферического условного стимула с прямым раздражением коры, вызывающим активацию двигательного центра (безусловный стимул), условный рефлекс или не вырабатывается, или требует большого числа сочетаний в течение нескольких дней, в то время как введение дополнительного подкрепления в виде пищи или стимуляции латерального гипоталамуса приводит к быстрой выработке условного рефлекса. Таким образом, в двухфакторных (см. рис. 23, Б, В) и трехфакторных (см. рис. 23, Г) схемах выработки ассоциативного научения должны быть учтены факторы, оказывающие дополнительный (модулирующий) вклад в эффективность обучения. Искусственная активация модулирующей системы соответствует «мотивационному возбуждению» и отражает модель достижения полезного результата, т. е. «эффект Торндайка». Иначе говоря, в механизмах обучения необходимо учитывать сигналы, зависящие от уровня мотивации, внимания, бодрствования и т. п. Эти модулирующие сигналы, воздействуя на мембранные механизмы (возрастание сопротивления и деполяризационные сдвиги мембранного потенциала) постсинаптического нейрона, переводят его в состояние повышенной возбудимости.
Функциональная гипотеза Дж. Экклса предполагает, что обучение состоит в длительных пластических изменениях межнейронных связей, представляющих собой стойкое повышение эффективности определенных синапсов в результате посттетанической потенциации. На клеточных аналогах корково-коркового условного рефлекса, где в качестве условного стимула использовалась прямая стимуляция через электрод участка коры, отдаленного от места регистрации активности коркового нейрона, а в качестве безусловного стимула — эффективное для регистрируемого нейрона раздражение ближайшей к нему поверхности коры, было обнаружено в большей части нейронов быстрое и кратковременное усиление ВПСП в результате развития механизма корковой посттетанической потенциации.
Для более точного анализа механизмов пластических перестроек исследователи пользуются регистрацией моносинаптических реакций, что составляет значительные методические трудности. Неоднократно предпринималась попытка экспериментальной проверки гипотетического механизма обучения по ассоциации пресинаптической активации и надпорогового возбуждения постсинаптического нейрона (см. рис. 23, В). Наиболее отчетливое и длительное усиление моносинаптических ВПСП и импульсной реакции нейрона (моторной коры кошки) были получены в опытах, где в качестве условного стимула использовалось раздражение пирамидного тракта, а безусловным стимулом служило внутриклеточное возбуждение этих же нейронов или их антидромная стимуляция. Опыты показали, что в значительной части нейронов (до 40% ) наблюдается отчетливое возрастание амплитуды ВПСП и сильное (в 10 раз) увеличение импульсного разряда клетки на условный стимул. Поскольку процедура псевдообусловливания (т. е. предъявление условных и безусловных стимулов в случайном порядке) оказалась неэффективной, полученные пластические перестройки рассматривают как аналогичные условнорефлекторным. Важно отметить, что сочетание условных стимулов с подпороговой (антидромной) активацией нейронов не приводило к выработке условного рефлекса. Из этих работ следует, что возрастание синаптической проводимости оказывает непосредственное воздействие на мембранные процессы нейрона (в форме изменения сопротивления и деполяризационного сдвига мембранного потенциала). Таким образом, эти данные указывают, что основной механизм условного рефлекса составляет процесс усиления эффективности синаптических связей при участии мембранных процессов нейрона.
Первые клеточные аналоги условного рефлекса были исследованы с помощью внутриклеточной регистрации на препарате морского моллюска аплизии [20]. При сочетании стимуляции двух периферических нервов было обнаружено существенное увеличение амплитуды ВПСП на ранее неэффективный условный стимул. Такой эффект синаптической модификации связан с механизмом гетеросинаптической фасилитации (облегчения). Последующими многочисленными исследованиями внутриклеточных механизмов различных форм пластических перестроек (привыкания, сенситизации, условных рефлексов) было показано, что ассоциация условных и безусловных стимулов происходит между сенсорными нейронами и нейронами, запускающими реализацию поведенческой реакции. Подкрепляемое действие условного стимула проявляется в эффекте усиления или облегчения ВПСП, регистрируемого в соответствующем командном нейроне (рис. 24). Модификация синапсов сенсорных нейронов, «подключающихся» в процедуре ассоциирования к командным или моторным
Рис. 24. Схема развития пресинаптического ассоциативного обучения в дуге пассивно-оборонительного поведения
(по Т.Н.Греченко, E.H. Соколову, 1987). УС — условный стимул, БС — безусловный стимул, Р — рецепторы, СН — сенсорные нейроны, НМ — модулирующий нейрон, КН — командный нейрон, МН —- мотонейроны, р — рефлекс; черный кружок — пластичный синапс, светлый — непластичный синапс
нейронам, осуществляется под воздействием нейромодулятора, выделяемого гуморально или синаптически. Найдены серотонинэргические нейроны, стимуляция которых вызывает возрастание ВПСП в командных (моторных) нейронах, реализующих рефлекс. Эти нейроны, облегчающие синаптический ответ на условный стимул, часто называют «подкрепляющими», или модулирующими. Таким образом, предполагается, что условный стимул вызывает ВПСП, а безусловный стимул через нейрон-модулятор влияет на эффективность условного синаптического входа. Ассоциативная специфичность обусловливается тем, что нейромодуляция избирательно усиливает пресинаптические механизмы функционально-активных клеток-мишеней (см. рис. 24).
Большинство исследователей пришли к выводу, что в основе гетеросинаптического облегчения (фасилитации) и поведенческой сенситизации (усиление рефлекса) лежит сложная цепочка механизмов: 1. Возбуждение нейронов-модуляторов приводит к фасилитации синаптических соединений сенсорных нейронов с нейронами, управляющими рефлексом. 2. Выделение нейромодулятора, нейропептида, активирующего (через аденилатциклазу) синтез вторичного передатчика (цАМФ) в этих синапсах, приводит к снижению калиевой проводимости и вызывает увеличение длительности потенциалов действия (ПД). Расширение ПД обнаруживают только сенсорные нейроны, подверженные ассоциированию; оно наступает через 5-15 мин после обучения и длится около 2 ч. 3. Увеличение длительности ПД приводит к долговременному возрастанию входящих токов кальция и соответственно к повышенному высвобождению медиатора.
Таким образом, участие синаптических соединений в качестве локусов пластичности и субстрата памяти широко признано, но вместе с тем процесс обучения связан не только с синаптическими, но и с мембранными и цитоплазматическими изменениями постсинаптических нейронов.
Убедительным фактом участия постсинаптического нейрона в ассоциативном «замыкании» служат эксперименты на полностью изолированном нейроне. Эксперименты по исследованию свойств мембраны изолированного нейрона были проведены многими авторами. Наиболее подробно исследования пластичности полностью изолированной сомы нейрона (моллюска) были проведены с помощью внутриклеточной стимуляции и «искусственных» синапсов. Опыты показали, что разные локусы соматической мембраны обладают гетерогенной чувствительностью к медиатору. На соме одного и того же нейрона существуют локусы, имеющие стабильный ответ, угасающий и неугасающий, фасилитирующий. Хемочувствительность различных точек мембраны независима. Внутриклеточная деполяризация сомы вызывает генерацию пейсмекерных потенциалов, которые, достигнув порога, приводят к возникновению ПД. Используя многократное применение внутриклеточных импульсов тока, были исследованы эндогенные механизмы угасания (« привыкания») и усиления («фасилитации») пейсмекерной активности. Пластичность эндогенных пейсмекерных потенциалов особенно ярко выражена в кальциевых каналах.
На изолированной соме нейрона Т.К. Греченко и E.H. Соколову удалось выполнить эксперименты по выработке неассоциативных и ассоциативных форм обучения, где использовались различные варианты ассоциирования стимулов. Например, в качестве условного подпорогового стимула использовалась микроаппликация медиатора (ацетилхолина или серотонина), в качестве безусловного стимула (эффективного относительно генерации потенциала действия) служил внутриклеточный деполяризационный импульс тока. Кроме того, использовались сочетания двух «искусственных» синапсов (например, две микропипетки с ацетилхолином) и другие варианты. В этих опытах продемонстрирована возможность выработки условной связи на ранее подпороговый стимул. Время сохранения модифицированной амплитуды ответа на условный стимул после сочетания с подкреплением различно для разных нейронов и достигает 5-40 мин и более. После достижения максимального уровня активности следовой эффект сохраняется в стабильном состоянии (в ряде случаев более 1 ч), затем неподкрепляемый условный ответ постепенно угасает. В работах по исследованию пластичности изолированной сомы нейрона исследователями подчеркиваются значительные совпадения полученных экспериментальных данных с «системной» феноменологией. Из этого следует, что, анализируя механизмы пластичности в нервной системе, необходимо учитывать не только процессы синаптической модификации, но и механизмы постсинаптической локализации следа памяти.
Поиску специфических веществ, ответственных за хранение информации о том или ином событии, посвящены многочисленные эксперименты. В настоящее время все этапы формирования, удержания и воспроизведения энграммы рассматривают от процессов синтеза и выброса нейромедиаторов до изменения метаболизма нуклеиновых кислот и белков. Эти этапы можно представить в форме последовательных биохимических процессов в нейроне: от изменения проницаемости наружных мембран, внутриклеточной концентрации ионов кальция, активации соответствующих ферментов (протеинкиназ) и фосфорилирования белков до усиления экспрессии (активации) генома нервных клеток. Возникающая активация генетического аппарата нейрона приводит к усилению синтеза информационных РНК и белков, часть которых, особенно специфических белков, транспортируется к определенным участкам соматической мембраны и обусловливает устойчивые изменения ее свойств. Указанные процессы в конечном итоге повышают возбудимость нейронов, облегчая узнавание нейронов и установление прочной функциональной связи между ними в ансамбле, в котором хранится след памяти.
В понимании природы энграммы исторически сложились две основные группы гипотез, составляющие, по мнению Р.И. Кругликова, две главные идейно-теоретические платформы для проводимых в настоящее
время исследований. Одна группа гипотез исходит из представления о кодировании индивидуального опыта в различных химических субстратах мозга — нуклеиновых кислотах, белках, особых пептидах. Другая группа гипотез исходит из представления о пластичной реорганизации межнейронных связей и формирования устойчивых многонейронных систем, представляющих собой структурный след памяти — энграмму.
Источником гипотез, основывающихся на допущении возможности кодирования информации в различных химических субстратах мозга, послужила широко известная с 60-х гг. гипотеза X. Хидена о кодировании приобретаемого навыка в последовательности нуклеотидов РНК нейронов с последующим синтезом на этой «обученной» РНК «запоминающих» белков. Первые эксперименты по биохимии памяти были проведены в конце 50-х гг. Е.М. Крепсом и X. Хиденом, показавшими (независимо друг от друга) достоверные изменения рибонуклеиновой кислоты (РНК) в мозге обучающихся животных. Сериями последующих работ различных авторов было установлено, что между силой условнорефлекторного возбуждения и концентрацией РНК в коре и ряде подкорковых образований существует четкая связь. Введение рибонуклеазы (РНКазы) внутрибрюшинно, интрацеребрально или на поверхность мозга (крыс и кроликов) вызывало исчезновение ранее выработанных условных рефлексов и затрудняло обучение новым навыкам. Тем самым было показано, что РНК играет важную роль в механизмах формирования и сохранения временной связи. Позднее, в 70-е гг. исследователи пришли к выводу, что в консолидации энграммы участвует белковая структура — ДНК, а РНК необходима для передачи специфического информационного кода. Эти выводы основывались на многочисленных опытах с применением блокаторов синтеза белков и РНК: рибонуклеазы, пуромицина и циклогексемида (ингибиторов трансляции), а также актиномицина Д (ингибитора транскрипции ДНК и РНК). Применение этих веществ в различные периоды после начала обучения предотвращает консолидацию следа памяти, формирование долгосрочного хранения энграммы. Уже тогда было показано, что процесс фиксации энграммы сопровождается увеличением синтеза РНК и белков и что при этом необходим нормальный уровень нейропередатчиков (в частности, ацетилхолина и катехоламина). Лишь в последние годы установлено, что существенное значение имеют моноаминэргические системы, а взаимодействие различных нейромедиаторных систем следует рассматривать как основу для формирования ассоциативной деятельности мозга.
Важным этапом в изучении химической природы памяти были экспериментальные попытки «транспорта памяти» от одних животных другим, когда путем инъекции мозговых экстрактов от животных-доноров, обученных несложному навыку, было получено облегчение обучения той же задаче животных реципиентов.
Наибольший резонанс в дискуссии о природе памяти получила в 70-е гг. гипотеза Г.Унгара, основанная на фактах накопления в мозге особого пептида, кодирующего страх темноты и способного транспортировать этот страх от животных обученных-доноров к необученным реципиентам. Этот пептид — скотофобин (от греч. «боязнь темноты») был синтезирован и использовался в различных лабораториях для проверки способности переноса химическим путем определенной информации. Было установлено, что скотофобин действительно вызывает стрессовую реакцию у животных, когда они находятся в темноте. Подобным же образом в лаборатории Г.Унгара вырабатывали у крыс привыкание к звуку электрического звонка, а затем экстрагировали и очистили активное вещество, которое было названо амелитином (от греч. «безразличный»).
При выработке у крыс рефлекса избегания темноты количество скотофобина возрастает в первые б дней обучения, затем количество его постепенно снижается и через 15 дней обнаружить его в мозге не удается. Синтетический скотофобин появляется в мозге через 15 мин после внутрибрюшинной инъекции, в течение 2-3 ч количество его возрастает и затем постепенно снижается. Через 48 ч его уже обнаружить не удается, хотя поведенческий эффект именно в этот момент достигает пика. Предполагается, что этот нейропептид связывается с каким-нибудь элементом в синаптических межнейронных связях и не может быть выявлен используемыми методами.
Основываясь на результатах экспериментов по «переносу навыка» и идее Р. Сперри о хемоспецифичности нейронов, Г. Унгар сформулировал привлекательную гипотезу. В этой гипотезе Г. Унгар допускает, что нейроны, обладая химическими метками, по которым они узнают друг друга в период эмбриогенеза, образуют многонейронные цепи (протоцепи). Эти протоцепи обладают способностью к пластическим перестройкам, в результате которых возникают новые нейронные цепи (метацепи), в которых записывается новая информация. Допускается, что заученное поведение, а следовательно, память, записывается в молекулярном коде. Субстратом такого кода являются пептиды, возникающие в мозге при обучении. Одновременная активация нейронов метацепи при обучении приводит, по Г. Унгару, к усилению синтеза в этих нейронах генетических меток и их переносу в специализированные нейроны, в которых содержатся специализированные ферменты — транспептидазы, синтезирующие из отдельных поступивших меток новый пептид. Этот новый пептид несет в себе код нового навыка и, внедряясь в активированные синаптические мембраны, приводит к формированию новых цепей нейронов (метацепей). В мозге животных-реципиентов образование таких метацепей составляет основу состояния обученности, возникающего без процедуры обучения — путем транспорта памяти.
Исследователи, следующие по пути поиска непосредственного химического кода приобретаемого навыка, предполагают, что в мозге может содержаться достаточное количество пептидов, чтобы обеспечить всю информацию, накапливаемую в течение жизни и оцениваемую в 1015 битов, поскольку, если пептиды имеют 15 аминокислотных остатков, как скотофобин, то может существовать 2015 пентадекапептидных цепочек, что значительно больше требуемого количества.
Положительные результаты опытов по «транспорту памяти» при помощи мозговых экстрактов одними исследователями интерпретировались как свидетельство о специфичности переноса навыка, как признание существования специфического (содержательного) химического кода определенного навыка, другими исследователями рассматривается как следствие общего облегчения консолидации следов памяти, как процесс переноса каких-то неспецифических субстратов обучения (возможно, пептидной природы), оказывающих модулирующее (регулирующее) влияние на эффективность синаптической передачи, способных модифицировать процесс обучения и памяти.
Большинство ученых считают, что гипотезы молекулярного кодирования индивидуального опыта не имеют прямых фактических доказательств. И хотя установлен факт существенной роли нуклеиновых кислот и белков в механизмах научения и памяти, однако в экспериментах, как правило, наблюдалось либо изменение белкового синтеза при обучении, либо существенное влияние ингибирования синтеза белков в нейронах на процесс формирования и закрепления следа памяти. Предполагается, что принимающие участие в формировании новой ассоциативной связи РНК и белки специфичны лишь по отношению к функциональному изменению задействованных синапсов и неспецифичны относительно самой информации.
В последние годы все большее внимание привлекает другая группа гипотез. По мнению авторов этих гипотез и их многочисленных сторонников, энграмму следует рассматривать как многонейронную систему, в которой хранение информации осуществляется за счет временных и пространственных межнейронных связей со стабильно повышенной эффективностью синаптической передачи. В основе стабильного повышения эффективности синаптической передачи, т. е. поддержания памятного следа выше «порога считывания», лежат изменения хемореактивных свойств церебральных нейронов, вовлекаемых в формирование энграммы, — структурный след памяти. При этом в интегративной деятельности нейрона сохраняется информационная значимость приходящих к нервной клетке гетерогенных возбуждений. В дифференцировке функционально различных синаптических связей участвует генетически закрепленный метаболизм нейрона, специфически развертывающийся по отношению к разным синапсам. В связи с этим со всей очевидностью выступает актуальность исследований роли молекулярно-генетического аппарата в специфической деятельности нейрона. Идея о внутринейрональном преобразовании синаптических возбуждений оказала плодотворное влияние на изучение молекулярных механизмов интегративной деятельности нейрона, механизмов метаболических процессов, обеспечивающих прием и внутриклеточное опосредование приходящей синаптической и нейрогуморальной информации. Для развития этих идей чрезвычайно важным оказалось открытие нескольких уровней регуляции синаптических связей между нейронами: участие вторичных посредников, фосфорилирование рецепторных белков и транссинаптическая индукция энзимов (ферментов), связанная с избирательной экспрессией генов нейрона.
Известно, что до недавнего времени процесс синаптической передачи представлялся в виде следующей цепи событий. Пришедший к пресинаптическому окончанию потенциал действия (ПД) вызывает активацию потенциалзависимой Са2+-проводимости. Ионы кальция через активацию специальных сократительных белков обеспечивают приближение синаптических везикул к мембране пресинаптического окончания и высвобождение нейромедиатора. Это Са2+-зависимое высвобождение нейромедиатора происходит дискретными порциями, или квантами. Нейропередатчик, достигший посредством диффузии постсинаптической мембраны, специфически активирует ее ионную проводимость. Эта проводимость не зависит от мембранного потенциала нейрона.
Инактивация нейропередатчика в синаптической щели осуществляется либо посредством его обратного захвата в пресинаптическое окончание, либо ферментативным разрушением. По этой схеме амплитуда постсинаптического потенциала зависит от количества высвобождаемого нейромедиатора и состояния медиаторных рецепторов (рецепторных белков) постсинаптической мембраны. Еще Ч. Шеррингтоном в 1906 г. было введено понятие нейронной интеграции, представляющее собой алгебраическую сумму конвергирующих к нейрону возбуждающих и тормозных
влияний. Эта сумма обеспечивается за счет таких пассивных свойств мембраны, как ее сопротивление, емкость, постоянная времени и постоянная длины .
Однако в целом ряде случаев взаимодействие двух постсинаптических потенциалов (вызванных активацией разных синаптических входов) не сводится к суммации, основанной на пассивных свойствах мембраны нейрона, а опосредуется специальными вторичными посредниками типа циклических нуклеотидов (такими, как цАМФ-аденозинмонофосфат, цГМФ-гуанозинмонофосфат).
К началу 70-х гг. появляются фактические данные о наличии в дополнение к классическим медиаторным эффектам механизмов, направленно регулирующих процессы межнейронных связей. Понятие нейромодуляции возникло из необходимости описать функциональное действие нейромедиаторных веществ, которые трудно интерпретировать с точки зрения классических представлений о синаптической передаче. В частности, появились такие данные, как сосуществование и совместное высвобождение двух медиаторов из окончания одного и того же нейрона или же данные о внесинаптическом высвобождении нейромедиаторов. Последние исследования выявили большое число сочетаний обычных классических медиаторов с пептидными нейромедиаторами в различных по локализации и по характеру окончаниях. Например, ацетилхолин с вазоинтестинальным пептидом и энкефалином, норадреналин с пептидом У и опиатными пептидами, серотонин с веществом Р, дофамин с энкефалином и др. Все больше появляется примеров сосуществования в одной терминали разных пептидов [3].
Нейромодулятор может изменять эффективность межнейронных связей, действуя либо на освобождение нейромедиатора (пресинаптическая модуляция), либо на постсинаптические эффекты нейромедиатора или на электрогенез постсинаптического нейрона (постсинаптическая модуляция). Нейромодуляторную функцию, помимо нейропептида, могут выполнять нейрогормоны и их фрагменты, а также и нейромедиаторы-спутники. Их пре- и постсинаптический модулирующий, эффект, как правило, опосредуется вторичными внутриклеточными посредниками. Например, описано длительное модулирующее действие одного синаптического входа на другой. Изолированная стимуляция дофаминэргического входа вызывала медленный тормозный постсинаптический потенциал (ТПСП) длительностью несколько минут, а при сочетании его стимуляции со стимуляцией холинэргического синаптического входа наблюдается потенциация дофаминэргического синаптического входа в виде возбуждающего постсинаптического потенциала (ВПСП), длящегося в течение несколько часов. Таким образом, нейромодуляторы в дополнение к классическим нейропередатчикам обеспечивают новый способ межнейронных коммуникаций, часто выступая в качестве стимуляторов обучения.
Установлено, что с выбросом из терминали медиатора (обычного классического типа) часто выделяются и сопутствующие ему нейропептиды. Нейропептид-спутник взаимодействует со специализированными рецепторами пре- и постсинаптических мембран (избирательно). Существуют факты об участии нейропептидов в обратной (пресинаптической) регуляции выброса основного медиатора, а что касается его действия на постсинаптические мембраны, то, во-первых, есть данные об увеличении выброса пептида-спутника именно при повышенной частоте импульсации, а во-вторых, показано, что пептид-спутник может значительно повышать сродство рецепторов постсинаптической мембраны к основному нейромедиатору, тем самым нейропептид, достигая клеток-мишеней, выступает как стимулятор обучаемости и консолидации, как модулятор, удерживающий повышенную активность определенного ансамбля нейронов. В какой-то мере эти новые данные подтверждают идею Г. Унгара о роли мозговых пептидов.
Концепция пресинаптической регуляции была впервые разработана для норадренергичёских синапсов периферической нервной системы позвоночных. Прежде всего в пресинаптических терминалях были обнаружены рецепторы к собственному медиатору, что обеспечивает поддержание концентрации медиатора в синаптической щели в определенных пределах, создает условия оптимального функционирования (механизм пресинаптической ауторегуляции). Например, обнаружено, что ß-адренорецепторы активируются низкими концентрациями норадреналина и вызывают усиление высвобождения нейромедиатора. При достижении более высоких концентраций норадреналина в синаптической щели α-адренорецепторами включается механизм, который ингибирует дальнейший выброс медиатора; Таким образом, норадреналин, активируя в зависимости от концентрации ß- или α-адренорецепторы, поддерживает свой стационарный уровень в синаптической щели в определенных физиологических пределах. Можно отметить, что механизм положительной обратной связи в модулирующихся синапсах обусловлен вторичными посредниками (увеличением концентрации ионов кальция и цАМФ в пресинаптических окончаниях, в синаптосоме) и последующим фосфорилированием мембранных белков, а механизм отрицательной обратной связи обусловлен, как предполагается, уменьшением притока кальция в клетку и, как следствие этого, ингибированием высвобождения нейропередатчика. Предполагается, что проникновение Са2+ в пресинаптическое окончание, вызванное его деполяризацией, является тем триггерным механизмом, который запускает Са2+-зависимое высвобождение нейромедиатора. В результате поступления кальция в деполяризованное окончание активируется фермент (аденилатциклаза), превращающий АТФ в цАМФ (или гуанилатциклаза превращает ГТФ в цГМФ), циклические нуклеотиды (в частности, цАМФ) в свою очередь активируют протеинкиназу, фосфорилирующую белки синаптических мембран, входящих в структуру ион-селективных Са2+-каналов. Это приводит к активации кальциевых каналов и еще большему поступлению кальция внутрь окончания и выведению из них ионов калия. Кроме того, цАМФ-зависимые протеинкиназы могут фосфорилировать различные белки синаптического окончания (белки эндоплазматического ретикулума, митохондрий, сократительные белки, а также белки пресинаптической мембраны и синаптических везикул). В результате этих процессов, как предполагается, индуцируется слипание мембран синаптических пузырьков с внутренней поверхностью пресинаптической мембраны и усиливается акт секреции и выброса медиатора.
Однако фосфорилированию могут подвергаться не только ион-селективные Са2+-каналы, но и К+-каналы. В серии работ Э. Кэндела с соавторами был показан феномен длительного синаптического облегчения (фасилитации), вызванного серотонином, высвобождения нейромедиатора из окончаний сенсорных, нейронов у моллюска. Это означает, что на пресинаптических окончаниях могут быть локализованы рецепторы не только к собственному медиатору, но и к другим медиаторам. Активация таких гетерорецепторов (медиатором-спутником) может приводить к усилению высвобождения основного медиатора, вызванного приходящим к окончанию ПД, т. е. наблюдается усиление эффективности синаптической передачи.
Таким образом, модуляторы (пептидные медиаторы, нейропептиды, нейрогормоны) могут влиять на процесс выброса нейропередатчика в синаптическую щель. В конечном итоге в пресинаптическом звене нейромодуляторы воздействуют на эффективность синаптической передачи через следующие процессы: 1) синтез медиатора; 2) депонирование его в везикулах; 3) сближение везикул с мембраной пресинаптического окончания и собственно выброс медиатора; 4) обратный захват высвободившегося нейромедиатора.
Относительно механизмов постсинаптической модуляции или основных биохимических событий, возникающих при длительном изменении проводимости синапса и участии постсинаптических процессов, нет единой гипотезы. Однако, исходя из современных данных, можно представить следующую последовательность ионных и молекулярных изменений, участвующих в фиксации следа памяти.
Выброс медиатора обычного типа (непептидного), его рецепция, взаимодействие с рецепторным белком постсинаптической мембраны и расщепление — процесс обычно длится менее 0,1 с. Вызванное медиатором изменение ионных потоков в постсинаптической мембране, изменение ее потенциала, генерация ПД и восстановление мембранного потенциала — менее 0,1 с. Измененная концентрация ионов калия в синаптической щели и вблизи нее при однократном импульсе сохраняется менее 0,1 с, при повторной импульсации может сохраняться в течение секунды и более. Возрастание внеклеточной концентрации ионов калия рядом исследователей рассматривается как фактор, включающий механизм консолидации посредством воздействия на ближайшие глиальные клетки. К перераспределению натрия и калия имеет непосредственное отношение метаболизм кальция. При активации нейрона увеличение внутриклеточной концентрации Са2+происходит за счет увеличения как пассивной, так и активной проницаемости Са2+-каналов наружной клеточной мембраны. Изменение внутриклеточной концентрации ионов кальция в области постсинаптической мембраны за счет входящего кальциевого тока включает разные реакции. Эффекты ионов Са2+ реализуются либо путем их непосредственного связывания с белками-мишенями, либо через посредство фосфорилирования мембранных белков специфическими Са2+-завискмыми протеинкиназами. Предполагается, что кальций активирует специфическую протеинкиназу, которая активирует рецепторный белок, т. е. неактивные до этого медиаторные рецепторы постсинаптической мембраны активируются и эффективность синаптической мембраны возрастает. Здесь можно отметить, что Са2+-зависимые протеинкиназы фосфорилируют ряд ферментов и клеточных белков (мембраны и цитоплазмы), которые влияют на состояние проводимости мембраны нейрона (процесс развертывается в пределах 10-20 м после импульсации) (рис. 25).
Существует предположение, что процесс электрогенеза, т. е. генерация импульса нейроном тоже запускает цикл биохимических процессов, опосредованных вторичными посредниками. Сюда включены индукция синтеза циклических нуклеотидов (цАМФ) и возрастание концентрации ионов кальция, активация ими ферментов — протеинкиназ, которые и осуществляют фосфорилирование белков.
Однако, как отмечает И.П. Ашмарин, в действии активированных протеинкиназ важно различать два эффекта. С одной стороны, протекает фосфорилирование белков и липидов мембраны клетки. С другой
Рис. 25. Схема развития посттетанической потенциации (по Т.Н. Греченко, E.H. Соколову, 1987).
Два контура управления: краткосрочный (медиатор—>Са2+ — протеинки-наза—>инактивация калиевого канала) и долгосрочный (медиатор—>Са2+—>белок-регулятор—>ядро—>иРНК—>синтез протеинкиназы—>усиление блокады калиевых каналов)
стороны, следует выделить процесс фосфорилирования гистонов и других регуляторных белков хроматина, т. е. белков — регуляторов активности генома нейрона. Этот процесс завершается синтезом ряда нейроспецифических белков.
Процессы, обусловливающие изменение состояния мембраны нейрона, развертываются в пределах 10-20 м после импульсации. В этом эффекте участвуют описанные процессы, вызванные действием обычного нейромедиатора, а также возможно участие и нейропептидов-спутников, воздействие которых состоит в относительно кратковременном (опосредованном «вторичными посредниками», а возможно, и прямом) действии на сродство рецепторов постсинаптической мембраны. Число активных рецепторов возрастает и возникает состояние повышенной проводимости синапса, удерживающееся 3-6 суток. Эффективность синапса может быть связана с длительным изменением мембранного потенциала постсинаптического нейрона. Например, нейрогормон АГТГ приводит к фосфорилированию ряда мембранных белков (особенно В-50) и обусловливает длительное уменьшение отрицательного заряда нейрона, тем самым определяется состояние его повышенной возбудимости.
Феномен синтеза нейроспецифических белков индуцируется процессом фосфорилирования регуляторных ядерных белков (белков хроматина). Установлено, что фосфорилирование гистонов, представленных в хроматине вместе с ДНК, осуществляется при участии опять-таки цАМФ-зависимых протеинкиназ. Это означает, что участие генетического аппарата в регуляции формирования следа памяти обеспечивается механизмами, в основе которых лежит принцип обратной связи: нейромедиатор (через вторичные посредники) принимает участие в активации генетического аппарата, а синтез нейроспецифических белков, часть которых участвует в ферментативной регуляции медиаторных рецепторов, индуцируется генетическим аппаратом. Иными словами, образование и устранение нейромедиатора регулируются ферментами, а синтез и регуляция ферментов осуществляются активацией генов, т.е. транссинаптической индукцией энзимов (ферментов), связанной с избирательной экспрессией генов.
Участие нейроспецифических белков в формировании следов памяти доказывается усилением их новообразования в процессе обучения и регистрации расстройства памяти при блокаде их синтеза. Усиление синтеза белков доказывается увеличением внедрения в них метки после предварительного введения меченых аминокислот. Феномен синтеза нейроспецифических белков проявляется в пределах часа после обучения и достигает максимума на 3-й и 6-й ч.
Начало исследования нейроспецифических белков мозга было положено в 1965 г. Б.Муром, который выделил и идентифицировал первый из них — белок S-100. К настоящему времени обнаружено свыше трех десятков мозгоспецифических белков, однако вследствие методических сложностей не все они выделены в очищенном виде. Имеются сведения их структурно-таксономического распределения. Так, белок S-100 содержится в мембранах, цитоплазме и ядрах клеток, белок ДНК-110 связан с рибосомами нейронов, ряд белков определяются в синаптических образованиях, а белки 14-3-2 и GP-350 нейрональны по происхождению и локализации. Кроме того, выделена группа белков исключительно глиальных элементов, в частности GFAP, 10В, NS-1, NS-2.
Общепризнанным является представление об исключительной роли мозгоспецифических белков в пластических модификациях, обеспечивающих фиксацию энграммы. Тем не менее убедительные данные об участии в функциях обучения и памяти получены лишь для двух нейроспецифических белков — S-100 и 14-3-2 (или гликопротеина). Об этом свидетельствуют данные о влиянии белка S-100 на фосфорилирование других белков в ядрах нейронов и об усилении синтеза РНК и белков в глиальных клетках. Было показано, что при переучивании крыс в гиппокампе усиливается новообразование именно этого белка. Отмечается, что нарастание синтеза белка S-100 в гиппокампе сопровождается параллельно увеличением концентрации ионов кальция. Интрацеребральное введение крысам антисыворотки к белку S-100 резко нарушает способность крыс к переучиванию. Позднее было обнаружено, что процесс обучения сопровождается новообразованием еще одного специфического белка — гликопротеина, при этом содержание одной из фракций гликопротеина увеличивалось более чем в 4 раза. У золотых рыбок процесс переучивания плавать по-новому (со специальным плавником) сопровождается усилением синтеза двух нейроспецифических гликопротеинов (эпендимов α и β). Интрацеребральная инъекция антиэпендиминовой иммунной сыворотки блокирует консолидацию памяти в этой задаче вестибуломоторного обучения.
Процесс обучения и сохранение выработанных навыков значительно нарушаются под действием ингибиторов синтеза РНК и белков (актиномицина Д, пуромицина, циклогексимида, анизомицина и др.). Путем торможения синтеза нейроспецифических белков был обнаружен холинорецепторный белок. Блокада синтеза рецепторного белка приводит к нарушению фиксации энграммы. Ряд литературных данных позволяет предполагать, что роль нейроспецифических белков, в частности белка S-100, в механизмах обучения заключается в обеспечении функциональной специфичности разных синаптических входов нейрона. Например, в экспериментах на простой модели обучения — привыкания к сенсорным раздражениям обнаружено, что антитела к белку S-100 значительно ускоряют снижение выраженных ответов в командных нейронах оборонительного рефлекса моллюска на повторные тактильные раздражения. Используя стимуляцию биологически неравнозначных участков тела моллюска, т.е. задействуя разные синаптические входы командного нейрона, было обнаружено, что белки S-100 и гамма-глобулины к ним различно влияют на эффективность синаптической передачи в разных входах нейрона. Позднее, в 1984 г. на полимодальных сенсорных входах к командным нейронам моллюска E.H. Соколовым и А.Г. Тер-Маргарян был получен эффект превращения «привыкающего» синапса в «непривыкающий». Блокада белкового синтеза анизомицином (в течение 8 ч и более) привела к «выключению» механизма синаптической пластичности. Торможение белкового синтеза привело к нарушению ферментативных реакций, способствующих пластическим перестройкам в синапсах. Таким образом, существуют основания считать, что продолжительное удержание следов памяти может обусловливаться синтезом нейроспецифических белков, участвующих в транссинаптической индукции ферментов, связанных с активацией (экспрессией) генов нейрона.
К отличительным особенностям генома нервных клеток относится их исключительно высокий по сравнению с другими тканями уровень функционально активных (транскрибируемых) уникальных последовательностей ДНК. Характерным для нервных клеток является прогрессирующее увеличение в них (в течение индивидуальной жизни) числа открытых для синтеза уникальных кодонов ДНК, чего не происходит в тканях других органов. В частности, у эмбриона человека в возрасте 22 недель число гибридных молекул ДНК/РНК, т. е. общее число генов, активных в нервной клетке, составляет 8,2%, а у взрослого человека эта величина достигает 24,6%, а в некоторых зонах мозга — 38%, тогда как в мышцах с возрастом она не меняется.
В онто- и филогенезе прогрессивно увеличивается в нервной ткани число уникальных кодонов ДНК, открытых для синтеза РНК и белков. Существуют доказательства, что транскрибируемость ДНК (а также ее синтез) в нейронах увеличивается как при обучении животных, так и при содержании их в условиях информационно обогащенной среды.
Согласно данным последних лет, объем гибридизации ДНК/РНК в таких отделах мозга, как кора, ретикулярная формация, продолговатый и средний мозг, четверохолмие, значительно различается, коррелируя с мощностью интегративных функций, приписываемых каждой из них. Характерно, что РНК, выделенная из лобной области коры, резко отличается по способности к гибридизации, значительно превосходя по этому показателю все вышеуказанные структуры.
Изучение метилирования ДНК различных нейронов, коррелирующего с их способностью к транскрипции (считыванию), выявило значительно более высокий уровень модификации в неокортексе. Примечательно, что ДНК неокортекса, особенно его гностических зон, у олигофренов существенно менее метилирована по сравнению с ДНК новорожденного ребенка, имеющего нормальную нервную систему.
В настоящее время накоплено немало фактов по интенсификации фракций РНК, часть которых отличается по составу от средних характеристик РНК контрольных нейронов. Однако сейчас принято считать, что «новосинтезируемая» РНК специфична для обучения вообще, а не для каждого вида стимуляции. Это можно продемонстрировать довольно известными экспериментами Э. Кэндела с соавторами по гибридизации РНК/ ДНК. Гибридизация РНК/ДНК проводилась путем использования немеченых препаратов ДНК и РНК из очищенных гонад моллюска и меченого препарата РНК из идентифицированного нейрона, который активировали синаптически. При сравнений РНК нейронов и гонад, т. е. функционально и структурно разных образований одного и того же животного, общей оказывается 92% РНК. Это означает, что только 8% РНК является специфичной для нервной клетки и только 4% ее вовлекается в процесс активации нейрона. При активации нейрона, когда усиливается процесс транскрипции (считывания), образуется новая РНК, но одновременно может быть использована и уже имеющаяся в клетке «нейрон-специфическая» РНК. Эти данные сейчас объясняют не синтезом РНК, в которой последовательность нуклеотидов не предшествовала ранее в клетке (например, в ДНК), а тем, что синтез определенной РНК (мРНК) отражает включение определенной комбинации экспрессированных участков генома. Иными словами, обучение объясняется не синтезом РНК, а активацией участков генома, ответственных за метаболизм нуклеиновых кислот и синтез «белков обучения».
Каким образом осуществляется избирательная активация определенной комбинации генов, отражающей ту или иную информацию, остается пока неясным. Существуют предположения, что нейромедиаторы, а также отдельные нейропептиды и нейрогормоны (типа АГТГ) могут проникать непосредственно внутрь ядра нейрона и включать модификацию белков хроматина и РНК, энзиматическое метилирование и избирательный синтез ДНК.
Из литературных источников известно, что существенное усиление процессов метилирования и синтеза ДНК после обучения достигает максимума к 2-3 ч и нормализуется через несколько суток. Исследователи считают, что метилирование ДНК можно рассматривать как один из эпизодов модификации ДНК, причем такая модификация ДНК может быть пожизненной. По мнению И.П. Ашмарина, даже наиболее устойчивые из известных белков организма имеют период полураспада (сутки, месяцы). Следовательно, в процессе фиксации памяти, включения в мембрану нейрона специфических белков, кодирующих новую информацию, должен одновременно запускаться какой-то механизм их обновления по устойчивому коду. Запись информации выступает как феномен включения (или выключения) участков генома, т.е. как усиление и модификация ДНК при обучении, активации и инактивации генов, ответственных за синтез и обновление белков, устойчиво изменяющих проводимость синапсов. Идея о возможности устойчивого включения — выключения (экспрессии-депрессии) генов, модификации ДНК метилированием-деметилированием была высказана Жакобом и Моно и до сих пор дискутируется.
Относительно механизмов модификации участков генома как феномена, ответственного за синтез и хранение кода «белков обучения», E.H. Соколов предлагает модель. Согласно его гипотетической модели вся мембрана нейрона функционально проецируется на геном (рис. 26). Каждому локусу мембраны, содержащему специфический рецепторный белок, на геноме соответствует определенный участок экс премированных или депрессированных генов. Воздействие медиатора или его спутника будет избирательно усиливать реактивность соответствующих ему рецепторных белков мембраны. Таким образом, каждый активированный участок мембраны выступает в форме «меченого белка». Белок-«метка» обладает специфической транслокационной группой и
Рис. 26. Гипотетическая схема отражения мембраны на геноме нейрона (по Т.Н. Греченко, E.H. Соколову, 1987).
ТЛБ — транслокационный белок, БР — белок-регулятор, БМ — белок-модулятор, иРНК — информационная рибонуклеиновая кислота
транспортируется к определенным участкам генома, вызывая избирательную экспрессию генов. В результате экспрессии определенных генов и при участии информационных молекул РНК происходит их транскрипция. Синтезируемый энзим (белок-модулятор) транспортируется белком к тому участку мембраны клетки, который был закодирован «маркерным» белком.
Эта схема предполагает, что экспрессия генов, вызванная однократно, затем длительно удерживается, обеспечивая поддержание уровня синтеза белков, регулирующих работу рецепторов, задействованных нейромедиатором активного синапса (см. рис. 26). По этой схеме переход от привыкания к выработке следа памяти происходит по пре- и постсинаптическому механизму (см. рис. 24). В случае выработки нового навыка, условного рефлекса должна начать действовать другая комбинация синапсов и нейромедиаторов. Действует другой белок-модулятор, который переводит соответствующий рецепторный белок в реактивное состояние, и он может длительно присоединять к себе специфический медиатор (см. рис. 25). На пресинаптическом уровне кальций, активируя протеинкиназу, запирает калиевые каналы и тем самым усиливает вход кальция и выброс нейромедиатора в синаптическую щель. На постсинаптическом уровне к активации натриевых каналов присоединяется вход кальция, включение протеинкиназы и выключение калиевых каналов, что повышает возбудимость нейрона. При участии генома нейрона усиливается синтез белков-модуляторов, влияющих на эффективность протеинкиназ, регулирующих закрытие калиевых каналов.
Таким образом, в основе кратковременной и долговременной памяти лежат пластические процессы в синаптическом аппарате и в самой соме нейрона.
Под пластичностью подразумевается длительное изменение свойств нейрона, влияющих на передачу сигнала. В основе мембранных процессов постсинаптической пластичности лежит изменение чувствительности и количества рецепторного белка. Изменение чувствительности рецепторного белка происходит под действием нейромедиатора, который переводит белок из неактивной формы в активную. Длительное сохранение таких изменений приводит к тому, что следующая порция медиатора окажет более сильное (или слабое) воздействие на проводимость постсинаптической мембраны нейрона, его возбудимость и дальнейшие биохимические преобразования в самой соме нейрона. Таким образом, процессы кратковременной памяти, ее временные последовательности динамично задействованных нервных элементов преобразуются в структурно-пространственную матрицу. Поэтому долговременная память сама по себе, вне момента ее образования и извлечения, представляется не процессом, а структурой (с многоуровневым пространственным распределением). В этом причина ее устойчивости к многочисленным внешним воздействиям, и в этом ее существенное отличие от сенсорной и кратковременной форм памяти, которые, по сути, являются процессами.