5.2.2. Електронно-мікроскопічне та цитохімічне дослідження процесу запліднення

Дослідження були проведені Дженсеном і Д. Фішером (1967). Було встановлено, що з ядрами жіночих клітин зливаються тільки ядра сперміїв, а цитоплазма сперміїв залишається в синергіді. В яйцеклітині і в центральній клітині цитоплазма сперміїв не виявляється. Встановлено, що об'єднання ядер гамет починається із злиття контактуючих мембран ядер гамет. Між ядрами виникає серія "містків", які починають розширюватись і зливаються від центра до периферії. Одночасно до периферії виштовхуються і органели, які знаходились між ядрами гамет. Мембрани ядер зливаються і хроматин спермія проникає в ядро яйцеклітини. Питання запліднення потребує подальшого дослідження.

Цитохімічні дослідження показали, що спермії, які входять у зародковий мішок, представлені компактними тілами, що дають інтенсивну реакцію Фельгена. В процесі злиття їх з ядрами жіночих клітин, внаслідок дсконденсації хроматина, інтенсивність реакції Фельгена знижується і реакція стає від'ємною.

При застосуванні фарбування за Браше (пиронін) виявлено, що спермії у зародковому мішку мають багряно-червоний колір, що свідчить про наявність у них РНК-компонента.

У проміжку між яйцеклітиною і центральною клітиною, в "щілині", спермії звільняються від РНК-компонента і стають синьо-зеленими, далі смарагдово-зеленими, тобто містять ДНП (дезоксирибонуклеопротеїди). В такому стані спермії вступають у контакт з ядрами жіночих клітин.

Метод люмінесцентного мікроскопічного спектрального аналізу показав зміни в хроматині сперміїв і ядер жіночих клітин під час послідовних фаз їх злиття. На прикладі Nicotiana було показано, що в процесі запліднення фізико-хімічний стан хроматина ядра яйцеклітини і центральної клітини змінюється по-різному. Вихідний стан хроматина яйцеклітини і центральної клітини різний.

В ядрі яйцеклітини хроматин, в основному, конденсований. В ядрі центральної клітини дифузний. В зв'язку з цим, при контакті із сперміями, зміна структури хроматина проходить тільки у яйцеклітині, хроматин ядра центральної клітини залишається без особливих змін (рис. 16).

Перебудова хроматина яйцеклітини зводилась до послаблення зв'язку ДНК з білками, що призводило до конденсації хроматина і до посилення зв'язку ДНК і РНК з ліпідами, можливо, внаслідок концентрації хроматина на мембрані ядра. Хроматин ядра яйцеклітини, таким чином, переходив поступово із конденсованого стану в дифузний і ставав подібний до хроматину ядра центральної клітини. Тільки після такої перебудови хроматина ядра яйцеклітини наступало об'єднання його із спермієм.

Хроматин ядра центральної клітини, після його контакту із спермієм, не підлягав перебудові, за винятком деякого посилення зв'язку його з мембраною ядра, що сприяло досить швидкому проникненню спермія у ядро центральної клітини.

Таким чином, одержані відомості з цитохімії запліднення свідчать, що швидкість проникнення сперміїв у ядра жіночих клітин залежить від вихідного стану хроматина їх ядер. Стан хроматину, очевидно, визначає взаємодію мембран ядер жіночих клітин і сперміїв і, у зв'язку з цим, впливає на темп процесу запліднення в цілому.

Дослідження жіночих ядер, які запліднюються на фазах, що відбуваються уже після проникнення в них сперміїв, показали: в ядрі яйцеклітини, після деконденсації хроматина її ядра і часткової деконденсації хроматина спермія, проходить збільшення кількості РНК, а потім вихід її в цитоплазму. Із ядра центральної клітини РНК виходить у цитоплазму трохи пізніше, ніж із ядра яйцеклітини, оскільки в ядрі центральної клітини до запліднення РНК було менше. В зв'язку з цим, для нагромадження необхідної кількості РНК в ядрі центральної клітини було необхідно більше часу, ніж для ядра яйцеклітини. В подальшому, при злитті ядер гамет, в їх хроматині спостерігається ще більше послаблення зв'язку нуклеїнових кислот з білками і посилення зв'язку з ліпідним комплексом, з ядерною мембраною, що є необхідною передумовою для процесів реплікації і транскрипції.

Після закінчення синтезу ДНК в ядрах знову виявляється ДНК, що зв'язана з білками. Наступає конденсація хроматина спермія, оскільки хроматин спермія вступає у профазу раніше хроматина ядра жіночої клітини. ДНК, з'єднана з білками, раніше виявляється у первинному ядрі ендосперму, ніж у ядрі зиготи, що свідчить про перехід його до швидшого поділу в порівнянні з ядром зиготи.

Стимул до злиття гамет мало досліджений. Існує дві точки зору:

1) ДНК спермія, яка вноситься в ядро жіночої клітини, стимулює його до поділу;

2) неактивне ядро жіночої клітини виходить із стану спокою під впливом цитоплазми пилкової трубки, яка, після запліднення, дає імпульс до подальшого його розвитку. Проте жодна з цих теорій не дає вичерпної відповіді на це важливе питання. Найбільш ймовірним є те, що стимул до злиття статевих ядер при заплідненні слід шукати у відмінності вихідного стану хроматина ядер - ядра яйцеклітини і спермія та ядра центральної клітини і спермія.