3.Основное уравнение хроматографии

Удерживаемый объем можно рассчитать, зная коэффициент распределения Dc и характеристики колонки.

Количество вещества после элюирования =

До окончательного элюирования количество вещества =

- объем подвижной фазы, равный рабочему объему колонки V₀. Его определяют измеряя удерживаемый объем несорбируемого вещества; - концентрация вещества в подвижной фазе; - объем неподвижной фазы; концентрация вещества в неподвижной фазе.

Поскольку элюируется все вещество, присутствовавшее в колонке:

(1)

(2)

Часто используют приведенный удерживаемый объем , скорректированный с учетом рабочего объема колонки :

(3)

Уравнение 3 представляет собой основное уравнение хроматографии. Оно показывает, что чем больше коэффициент распределения Dc, тем больше V_R и чем больше объем неподвижной фазы Vн, тем больше V_R. В свою очередь Vн зависит от длины и диаметра колонки.

Эффективность разделения пропорциональна длине колонки, но при увеличении ее длины происходит размывание зоны каждого ком­понента и, следовательно, расширение пиков (ширина пика пропор­циональна времени нахождения вещества в колонке), поэтому длину колонки необходимо ограничивать.

4.Газовая хроматография

Колоночная газовая хроматография является методом разделения летучих веществ: газов (при нормальной температуре) или паров (при повышенной температуре). В качестве неподвижной фазы в газовой хроматографии используются твердые материалы (насадочные или набивные ко­лонки), твердые материалы, покрытые слоем жидкости, или же капил­ляры с нанесенным на внутреннюю поверхность слоем жидкости (ка­пиллярные колонки). В качестве подвижной фазы используют газ-носитель, перено­сящий разделяемые вещества через колонку. Разделение анализируе­мой смеси осуществляется за счет различного времени удерживания компонентов пробы в неподвижной фазе.

Основные группы органических веществ, которые могут быть оп­ределены методом газовой хроматографии, включают газы, летучие жидкие соединения, твердые частицы, жидкие аэрозоли и главным требованием для ве­ществ, разделяемых газовой хроматографией, является их достаточная устойчивость при температурах, которые необходимы для поддержания биопробы в газо­образном состоянии.

Между жидкостной и газовой хроматографией не существует принципиальной разницы. Газовая хроматография отличается лишь свойствами подвиж­ной фазы: высокой скоростью диффузии газа-носителя и его способно­стью сжиматься. Достоинствами газовой хроматографии являются:

• возможность идентификации и количественного определения индивидуальных компонентов сложных смесей;

• возможность анализа широкого круга объектов — от легких га­зов до органических соединений и некоторых металлов;

• высокая четкость разделения и быстрота процесса, обусловлен­ная низкой вязкостью подвижной фазы;

• возможность исследования микропроб и автоматизация записи получаемых результатов, обусловленная наличием чувствительных и малоинерционных детекторов;

• возможность выделения чистых веществ в промышленных мас­штабах;

• пригодность для исследования малых объемов жидких биопроб (0,01...50 мкл).

Максимальная разделяющая способность колонки в ГХ зависит от:

• количества НФ, качества упаковки, толщины слоя;

• размера (диапазона размеров) частиц материала-носителя;

• размеров колонки;

• вязкости газа-носителя (следовательно, и температуры в ко­лонке).

В газоад­сорбционной в качестве неподвижной фазы используется ад­сорбент, а в основе разделения лежит механизм адсорбции; в газожидкостной неподвижной фазой является жидкость, нанесенная на инертный мате­риал-носитель, а в основе разделения лежит распределительный меха­низм. Растворимость анализируемых веществ в неподвижной фазе определяется зави­симостью давления паров растворенного вещества от его концентра­ции в жидкой фазе.

Вид хроматограммы, полученной в изотермических условиях, представлен на рис.7. Время удерживания конкретного компонента в колонке зависит от вероятности попадания молекул вещества в подвижной фазе. При этом компоненты с высоким давлением паров и соответственно низкой растворимостью в неподвижной фазе удерживаются слабее и, наоборот, веще­ства с низким давлением пара и высокой растворимостью элюируются позже.

Рис.7. Хроматограмма, полученная в изотермических условиях.

В газовом хроматографе (рис. 8) газ-носитель из баллона 1 через регуляторы расхода и давления непрерывно с постоянной или переменной скоростью подается в хроматографическую трубку-колонку 3, заполненную сорбентом и помещённую в термостат 4, позволяющий поддерживать заданную температуру [1]. Ввод газообразной или жидкой пробы осуществляется дозаторами 2, регулирующими объём пробы с помощью электромагнитных клапанов (ЭМК).

Рис. 8. Структурная схема газового хроматографа

1 – баллон с газом-носителем; 2 – дозатор пробы; 3 – хроматографическая трубка-колонка; 4 – термостат; 5 – детектор; 6 – электрический сигнал; 7 – хроматограмма

В газовой хроматографии применяют три типа колонок:

Рис.9. Типы колонок для газовой хроматографии: а – насадочная колонка; б – тонкослойная капиллярная колонка (SCOT - колонка); в – классическая капиллярная колонка.

1. Насадочные колонки. Такие колонки изготовливаются из стек­лянных или металлических трубок (нержавеющая сталь) U-образной или спиралевидной формы. Они характеризуются большой поверхно­стью и высокой разделяющей способностью, однако обладают боль­шим сопротивлением, что ведет к неравномерности потока газа-носителя. Хотя теоретически разделяющая способность растет с увеличе­нием длины колонки, на практике преимущество длинных колонок сводится на нет из-за увеличения сопротивления. Оптимальной дли­ной насадочной колонки является 0,5...10 м при внутреннем диаметре 1...5 мм.

2. Тонкослойные капиллярные колонки. Этот тип колонок занимает промежуточное место между насадочными и классическими ка­пиллярными колонками. Их внутренняя поверхность покрыта тонким слоем мелкодисперсного сорбента, пропитанного жидкой фазой. По разделяющей способности они превосходят насадочные, так как обла­дают меньшим сопротивлением.

3. Капиллярные колонки из стекла или нержавеющей стали. При равной длине с насадочными колонками такие колонки обладают существенно меньшим сопротивлением, имеют длину до 200 м при внутреннем диаметре 0,3...0,5 мм. Эффективность капиллярных коло­нок в 100 раз выше, чем насадочных. Преимуществом их является возможность изготовления из кварцевого стекла, что придает им свойство гибкости — их можно даже завязывать в узел или придавать любую форму. Однако такие колонки предъявляют жесткие требования к уст­ройствам ввода пробы и к выбору детектора.

Основные характеристики колонок для газовой хроматографии представлены в табл.2.

Таблица 2. Характеристики колонок для газовой хроматографии.

Параметр	Тип колонки
	насадочные	Капиллярные
Длина, м	1...6	10... 100
Внутренний диаметр, мм	2...4	0,25...0,3555
Емкость	10мкг/пик	50 нг/пик
Толщина пленки НФ, мкл	1...10	0,05...0,5
Скорость газа-носителя, мл/мин	10...60	0,5…10
Перепад давления по колонке, атм	0,6...2,4	0,18...2,4

Устройства ввода пробы. Способ ввода биопробы зависит от ее вида (жидкая или газообразная) и типа колонки. При разделении жидкостей в насадочных колонках биопробу вводят шприцем, прока­лывая иглой мембрану (пробку из силиконовой резины), при этом биопроба потоком газа-носителя уносится в колонку. При введении газовых и невязких жидких биопроб область ввода иглы нагревают, чтобы она сразу испарилась. Твердую биопробу предварительно пе­реводят в раствор.

При работе на капиллярных колонках биопробу вводят при помо­щи делителя потока, в котором она попадает сначала в канал испаре­ния, после чего разбавляется газом-носителем. Большая часть газовой смеси уходит на сброс, меньшая - в колонку. При автоматизирован­ном анализе газовых смесей биопробу вводят при помощи дозирую­щей петли.

Материалы-носители. Газоадсорбционную хроматографию применяют с целью разделения га­зов или низкокипящих веществ и обнаружения газообразных примесей в воздухе. В качестве адсорбентов применяют:

• активированные угли или графитированные сажи;

• пористые синтетические полимеры;

• пористые неорганические материалы (молекулярные сита).

Нанесенная жидкая фаза в колонках для газоадсорбционной хроматографии не применяется.

В газожидкостной хроматографии сорбенты выполняют функцию носителей жидкой неподвижной фазы и не оказывают влияния на процесс разделения.

Технологическая процедура подготовки пробы может осуществ­ляться различными способами. Для анализа паров над жидкой или твердой фазой (например, при определении спирта в пробе крови) разработана специальная методика Неаd-Sрасе-Аnаlуsе (из объема над жидкостью). Необходимое количе­ство пробы газа отбирают с помощью пробоотборника непосредствен­но из емкости для хранения. По другой методике биопробу потоком воздуха направляют в охлаждаемую ловушку и замораживают. Третий вариант заключается в том, что газ при пониженной температуре ад­сорбируют на короткой колонке, затем при повышении температуры десорбируют и направляют в рабочую колонку. При анализе влажных биопроб не допускается конденсация воды в колонке, для этого биопробу осушают. Твердые частицы в аэрозолях отделяют с помощью бумажных салфеток или фильтрующих патронов. При анализе жидких биопроб, содержащих компоненты с различной температурой кипения, исключают возможность конденсации компо­нентов в дозирующем шприце, для этого шприц нагревают, не допус­кая разложения биопробы.

Основные стадии технологической процедуры анализав газовой хроматографии несколько отличаются от рассмотренных ранее.

1. Подготовка колонки. Колонку промывают специальным рас­твором, а затем высушивают в потоке воздуха, очищенного от пыли и капель масла.