9. Гель-хроматография.

Гель-хроматография (молекулярно-ситовая хроматография) — метод, основанный на различной способности молекул раз­ного размера проникать в поры нейтрального геля, который служит неподвижной фазой.

Схематично принцип работы молекулярных сит представлен на рис.3, где последовательно показаны стадии прохождения молекул разного размера через колонку. В качестве неподвижной фазы используется гель, имеющий поры определенного диаметра, поэтому более крупные мо­лекулы не диффундируют в поры гранул и элюируются (вымываются) быстрее, в то время как молекулы небольшого размера удерживаются в порах и элюируются позже.

Хроматографические свойства геля определяются природой матри­цы и, прежде всего, пористостью ее структуры. В зависимости от спо­собности набухать в воде или в органических растворителях материа­лы для гель-хроматографии подразделяются на гидрофильные и органофильные (гидрофобные). К ним предъявляются определенные требования: они должны быть пористыми со средними размерами пор, не должны обладать сорбционной способностью и иметь высокую механическую прочность.

Рис.3. Принцип работы молекулярных сит

Самыми распространенными носителями являются сефадексы с различными размерами пор, а также полиакриламида, агарозные гели, сефакрил, гидрогель и некоторые другие. Для гель-хроматографии при высоком давлении применяют носители на основе пористого силикагеля и по­ристого стекла. Эффективность разделения слабо зависит от типа элюента.

Отметим основные стадии технологической процедуры анализа при гель-хроматографии.

1. Заполнение колонок.

2. Нанесение биопробы при помощи шприца.

3. Элюирование. Скорость подачи элюэнта регулируют посредст­ вом изменения перепада гидростатического давления или задают при помощи насоса.

Область применения гель-хроматографии достаточно широка и включает:

• фракционирование и выделение в водной среде и органических растворителях белков, липидов, стероидов, нуклеиновых кислот и по­лимеров;

• разделение различных веществ в препаративном масштабе (на­пример, биотехнологическое производство);

• определение мольных масс биополимеров, в том числе в соста­ве сложных смесей;

• определение степени полимеризации синтетических полимеров;

• фракционирование субклеточных частиц, вирусов;

• отделение радиоактивных низкомолекулярных веществ при вве­дении изотопной метки в биополимеры.

10. Тонкослойная хроматография.

В зависимости от аппаратурного оформления процесса разделения различают хроматографию в колонках различных типов и в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография). Данный вариант приобрел большое распространение в медико-биологических лаборато­риях благодаря ряду преимуществ. В частности, это объясняется тем, что хроматографию на пластинках проводят в очень мягких условиях, что позволяет анализировать нестойкие вещества, которые не могут переносить продолжительные по времени операции преобразований.

Тонкослойная хроматография основана на различии скоростей перемещения компонентов анализируемой пробы в плоском тонком слое сорбента при движении по нему растворителя (элюента) под действием капиллярных или гра­витационных сил. Разделение в этом методе осуществляется посредст­вом многократного пересечения молекулами вещества границы фаз, т. е. вследствие многократного повторения акта распределения вещест­ва между подвижной и неподвижной фазами. Неподвижной фазой служит либо сухой сорбент (адсорбционная хроматография), либо сорбент, покрытый жидкой фа­зой, например, слоем воды (распределительная хроматография). Рас­творители подбирают в соответствии со свойствами разделяемых ве­ществ.

Можно выделить несколько вариантов тонкослойная хроматография в зависимости от принципа движения элюента:

1. движение элюента под действием капиллярных сил (бумажная, тонкослойная и высокоэффективная тонкослойная хроматография);

2. движение элюента под действием внешних сил:

   • давления;

   • центробежной силы (ротационная хроматография);

   • высокого давления (круговая тонкослойная хроматография под высоким давлением).

Принцип проведения тонкослойная хроматография показан на рис.4. Исследуемая биопроба вносится на стартовую линию «а-а». По мере продвижения вдоль слоя сорбента проба разделяется на компоненты, образующие на его поверхности характерные пятна (зоны). В различных системах рас­творители (подвижной фазы) обладают разной подвижностью. Количественно подвижность выражается величиной фактора удерживания R_f , определяе­мого выражением R_f = -X_i / X_эл ,где X_i — расстояния от стартовой линии до середины соответствующе­го пятна i-го компонента после окончания разделения; Х_эя - длина пути элюента — расстояние от стартовой линии до итоговой линии фронта растворителя («в-в»).

Рис.4. Схема проведения тонкослойной хроматографии.

Тонкослойная хроматография используют как препаративный и аналитический методы, которые обеспечивают разделение и исследование биопроб с массой в пределах 10^-3...10^-12. Количественная тонкослойная хроматография включает в себя два оди­наково важных этапа: разделение смеси веществ и их качественное или количественное определение, которые удачным образом совмеща­ются в едином процессе. Препаративная тонкослойная хроматография используется для выде­ления всех классов веществ (от 1 мг до 10 г) из сложных смесей. Раз­деленные компоненты в виде пятен на пластинке можно затем иденти­фицировать другими аналитическими методами: спектрофотометрией в УФ, видимой и ИК-областях спектра, ЯМР-спектроскопией, масс-спектрометрией и др.

Преимущества тонкослойная хроматография перед колоночной хроматографией заключаются в следующем:

• простота и легкость исследования;

• исключение предварительной подготовки биопробы, поэтому анализу могут подвергаться смеси природных или синтетических ее единений;

• дешевый универсальный сорбент — силикагель и пластинки од­норазового использования;

• возможность нанесения одновременно нескольких биопроб;

• быстрота анализа;

• возможность непосредственного наблюдения за процессом элюирования и простота интерпретации результатов;

• возможность создания отчетных документов, например, путем фотографирования пластинок;

• низкая стоимость оборудования.

Можно выделить следующие стадии технологи­ческой процедуры исследования для тонкослойной хроматографии: