5.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

Высокоэффективная жидкостная хроматография представляет собой метод разделения веществ на мелкозернистых сор­бентах (с размерами частиц 3...15 мкм) при повышенном давлении. Ме­тод характеризуется высокой эффективностью разделения в сочетании с высокой скоростью процесса. Высокое разрешение, а следовательно, возмож­ность использования коротких колонок позволяют сократить продол­жительность процесса и уменьшить расход растворителей. Обязатель­ными также являются высокое качество устройства ввода пробы и ми­нимальный объем измерительной ячейки детектора.

К подвижным фазам предъявляются особые требования:

• высокое качество очистки (особо чистые растворители);

• отсутствие взвешенных частиц (фильтрование на входе колонки на фильтре с диаметром пор менее 4 мкм);

• минимальная вязкость;

• учет условий работы детектора (растворитель не должен поглощать при рабочей длине волны);

• отсутствие ионов, способных вызывать коррозию металличе­ских частей хроматографа.

Структурная схема многоцелевого жидкостного хроматографа, ис­пользующего методику градиентного элюирования, представлена на рис.6. Из крана-смесителя жидкая подвижная фаза под высоким давлением по­ступает в хроматограф, который находится в термостате, сначала — через змеевик, где она принимает рабочую температуру, затем — че­рез предколонку с той же насадкой, что и основная колонка. Предколонка выполняет следующие функции:

• достижение равновесия между подвижной фазой и сорбентом;

• роль фильтра, удаляющего оставшиеся примеси.

Биопробу вводят между предколонкой и основной колонкой. Элю­ат из колонки проходит через измерительную ячейку дифференциаль­ного детектора к коллектору фракций или сливу. Поток элюента, про­ходящего через сравнительную ячейку детектора, отделяют от основ­ного потока элюента до ввода биопробы. В более простых и дешевых системах могут отсутствовать следующие блоки: змеевик (нет контро­ля температуры), предколонка, а также может использоваться более простой детектор.

6.Адсорбционная хроматография.

Адсорбционная хроматография основана на различной степени ад­сорбции компонентов исследуемой пробы на пористом адсорбенте. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают твердожидкостную адсорбционную или газоадсорбционную хроматографию.

Пористые материалы обладают способностью достаточно прочно сорбировать различные вещества. В твердожидкостном варианте на границе твердой и жидкой фаз частицы твердого адсорбента обтекают­ся подвижной фазой, несущей в растворенном виде анализируемую биопробу. Ее разделение происходит за счет того, что компоненты с различной прочностью удерживаются на поверхности адсорбента. При выполне­нии газоадсорбционного варианта растворитель заменяется на газ-но­ситель, который переносит по колонке газообразную смесь компонен­тов биопробы.

В качестве неподвижной фазы в адсорбционной хроматографии используются не­сколько видов материалов.

Силикагель. Этот материал получают из золей кремневой кислоты, при этом в зависимости от условий проведения реакции образуются нерегулярные или сферические частицы различной величины и порис­тости. Хроматографию при нормальном давлении обычно проводят на сорбентах с размерами частиц 40...60 мкм, при высоком давлении — на сорбентах с размерами 3, 5, 7, 10 мкм. Важной характеристикой сорбента наряду с размерами частиц является средний диаметр их пор.

Силикагели применяются:

• для фракционирования неполярных и малополярных веществ;

• контроля качества разделения (главным образом, при высоком давлении на колонках с размером частиц 3...15 мкм);

• препаративного фракционирования при нормальном давлении на сорбентах с размерами частиц 10...30 мкм;

• препаративного разделения в производственном масштабе на сорбентах с диаметрами частиц 60...200 и 200...500 мкм.

Оксид алюминия. Этот адсорбент характеризуется не только раз­мерами частиц, но и кислотно-основными свойствами: водная сус­пензия адсорбента может иметь кислую, нейтральную или основную реакцию. Кроме того, адсорбент может обладать различной степенью активности.

Оксид алюминия применяют для решения тех же задач, что и силикагель: на кислом оксиде алюминия разделяют вещества с кислот­ными свойствами (фенолы, карбоновые кислоты). На основном окси­де алюминия фракционируют основания (амины), а также удаляют перекиси, присутствующие в органических растворителях (эфире, диоксане и др.).

Поверхностно-модифицированный силикагель. К находящимся на поверхности частиц диоксида кремния атомам Si могут быть прикреп­лены различные группы (например, посредством ковалентной связи), полностью покрывающие поверхность силикагеля, вследствие чего по­лярный сорбент приобретает гидрофобные свойства. Наиболее прочная адсорбция неполярных и умеренно полярных соединений наблюдается в водной среде. Десорбция происходит в присутствии органических растворителей. Поверхностно-модифицированные силикагели приме­няют, в основном, в хроматографии с обращенными фазами для аналитического и полупрепаративного разделения, главным образом, поляр­ных веществ.

Производные агарозы различных марок. В этом виде адсорбента в качестве основы (матрицы) используется агароза, сшитая специальным химическим соединением, которая несет гидрофобные группы сорбен­та, способные вступать во взаимодействие с цепями аминокислотных остатков белков. Производные агарозы применяются для фракциони­рования белков по их гидрофобным свойствам. Разделение проводится в водной среде (что важно при работе с белками).

В колоночной хроматографии применяются и другие адсорбенты:

• целлюлоза;

• производные декстрана (сефасорб и др.), представляющие собой жестко сшитый гидроксипропильными мостиками слабонабухающий декстран. За счет жесткости структуры частицы сефасорба устойчивы при давлении до 10⁷ Па. Сорбент производится в виде мелкого порош­ка (с диаметром частиц до 10...23 мкм), что позволяет существенно по­высить разрешающую способность.

Технологическая процедура пробоподготовки в адсорбционной хроматографии имеет неко­торые особенности. При проведении колончатой хроматографии био­пробу предварительно растворяют в элюенте, а при необходимости — дополнительно фильтруют или центрифугируют с целью удаления примесей (пылинок, коллоидных частиц). Поскольку при клинических анализах часто возникает необходимость в определении небольших ко­личеств органических веществ в большом объеме биологических жид­костей (мочи, ликвора и др.), то в ряде случаев используют достаточно сложную процедуру получения исходного вещества биопробы (присутствие в пробах солей и белков заметно затрудняет проведение анализа).

Технологическая процедура анализа методом твёрдожидкостной адсорбционной хроматографии включает следующие операции.

1. Подготовка колонки. Как правило, сорбент суспендируют в растворителе, в котором предполагается проводить элюирование, а за­ тем проводят деаэрацию в вакууме. Силикагель предварительно обра­батывают ультразвуком.

2. Нанесение биопробы. Биопробу растворяют в растворителе, в котором предполагается проводить элюирование. При препаративном разделении емкость сорбента используется максимально, а в аналитическом варианте объем биопробы не должен превышать 2 % от объема колонки (перегрузка колонки при высокой концентрации вещества нарушает ее работу).

3. Разделение. Полярность элюентов оказывает существенное влияние на качество разделения, поэтому их подбирают с учетом определенных требований. Если биопроба состоит из компонентов различ­ной полярности, то элюирование проводят в условиях возрастания или снижения полярности растворителя. Замена элюента может осуществ­ляться ступенчато или плавно при помощи специального градиентного смесителя на входе колонки.