7. Распределительная хроматография.

Распределительная хроматография основана на различии в распределении компонентов пробы между двумя компонентами систе­мы, содержащей не смешиваемые жидкие фазы - подвижную фазу и неподвижную, которая нанесена на твердый носитель. Компоненты биопробы, растворенной в такой системе, распределяются между жид­кими фазами в зависимости от степени их растворимости в этих фазах или, точнее, в соответствии с их сродством к этим фазам. В зависимо­сти от состояния подвижной фазы процесс носит название либо жидко-жидкостной, либо газо-жидкостной распределительной хроматографии.

При проведении газо-жидкостной распределительной хроматографии на границе подвижной и неподвижной фаз пузырьки газа проходят через жидкость, в которой растворены компоненты пробы, тогда на поверхности раздела концентрируются компоненты с боль­шой поверхностной активностью и после оседания их можно выделить (редко используется на практике).

Чтобы жидкие фазы не смешивались, они должны сильно отли­чаться по степени полярности. Обычно полярный растворитель (спирт или вода) наносится на пористый носитель (силикагель, оксид алюми­ния, силикат магния). Важным преимуществом жидко-жидкостной распределительной хроматографии по сравне­нию с твёрдожидкостной адсорбционной хроматографии является то, что жидкую подвижную фазу легче менять без пере­набивки колонки. Но с другой стороны легкость удаления неподвижной фазы приво­дит к возможности ее вымывания.

В распределительной хроматографии большое значение имеет прочность удерживания жидкой неподвижной фазы на нерастворимом, инертном твердом носителе. Неподвижная фаза закрепляется на носителе за счет адсорбции и проникновения в поры. Прочность удерживания определяется также силами адгезии и химическими свя­зями.

Распределительная хроматография может использоваться при ана­лизе всех классов веществ, в особенности, для разделения довольно сложных смесей. Чаще всего жидко-жидкостной распределительной хроматографии используется для разделения низкомолекулярных соединений - аминокислот, гормонов, витами­нов, синтетических лекарств и др.

8. Ионообменная хроматография.

В отличие от адсорбционной, в основе ионообменной хроматогра­фии лежат электростатические взаимодействия. Она осно­вана на различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с ионитом — специальным веществом, которое вводится в неподвижной фазе, пре­вращая ее тем самым в ионообменник.

Ионит представляет собой нерастворимую полимерную основу (матрицу), несущую химически связанные ионогенные группы (группы ионов, способных взаимодействовать за счет электростатических сил с ионами противоположного знака). Противоположно заряженные ионы удерживаются на матрице за счет сил электростатического взаимодей­ствия и могут обмениваться на другие ионы (компоненты пробы), при­сутствующие в подвижной фазе.

Многие вещества биологического происхождения содержат так на­зываемые ионогенные группы, которые являются остатками сильных или слабых кислот и оснований. Вещества, участвующие в ионообменной хроматогра­фии, всегда являются либо цвиттер-ионами (в целом нейтральные молеку­лы, несущие равное число положительных и отрицательных зарядов), либо амфолитами (крупные молекулы, на поверхности которых распо­лагается несколько ионогенных групп, способных заряжаться). Амино­кислоты, пептиды и белки — типичные амфолиты, при этом в зависи­мости от рН среды и ее химического состава они могут быть либо за­ряжены, либо быть нейтральными.

Таким образом, в ионообменной хроматогра­фии для разделения веществ используются различия в их электрических свойствах. В качестве примера ионооб­менного процесса можно привести операцию смягчения воды, при ко­торой ионы кальция и магния обмениваются на ионы натрия. Помимо обычного обмена ионов на ионитах можно проводить разделение заря­женных частиц, прежде всего биополимеров (белки, нуклеиновые ки­слоты), некоторые из которых обладают амфотерными свойствами.

В качестве подвижной фазы для ионообменной хроматогра­фии выступает вода, а в качестве сорбентов используются твердые или гелевые матрицы, к которым ковалентно пришиты ионогенные группы. Сорбент в целом электронейтрален, од­нако в водной среде часть ионов диссоциирует, и в любой момент ка­кое-то количество фиксированных зарядов оказывается свободным. Если в подвижной фазе имеются вещества в ионизированной форме и их заряд противоположен, то они за счет электростатических взаимодействий удерживаются на свободных фиксированных зарядах ионообменника, и в результате при движении элюента по колонке происходит разделе­ние компонентов биопробы за счет ионного обмена.

По своему химическому строению матрицы ионообменника под­разделяются на несколько групп:

• синтетические смолы на основе полистирола или полиакриламида;

• сефадексы на основе сшитого декстрана;

• сефарозы (на основе агарозы);

• целлюлозные ионообменники на основе микрокристаллической или сшитой микросферической целлюлозы;

• неорганические иониты на основе поверхностно-модифицированных силикагелей.

В отличие от других видов хроматографии, при ионообменной хроматогра­фии всегда ис­пользуют элюент переменного состава. При этом ионную силу раство­ра изменяют при помощи градиентного смесителя следующим обра­зом. В начале процесса на колонку из смесителя подают элюент с низ­кой ионной силой. По мере изменения объема раствора в смеситель из отдельного резервуара начинает поступать буфер с высокой ионной силой, при этом содержимое смесителя непрерывно перемешивается при помощи магнитной мешалки. В результате ионная сила элюента, подаваемого на колонку, постепенно возрастает, и формируется линей­ный градиент концентрации буферного раствора. Процесс разделения завершается при концентрации буфера, находящегося в резервуаре.

Рассмотрим основные стадии технологической процедуры анализа при проведении ионообменной хроматогра­фии.

1. Подготовка биопробы. Содержание солей в биопробе должно быть минимальным, поэтому при необходимости проводится ее обессоливание с помощью гель-хроматографии или диализа, либо ее раз­бавление.

2. Подготовка ионита. Необходимое количество ионита рассчитывают по его емкости, но не более 10 % объема сорбента, так как в ос­тальном объеме осуществляется собственно процесс разделения. Перед каждым циклом разделения ионит обязательно подвергается полной регенерации (переводится в активную форму).

3. Заполнение колонки производится так же, как в адсорбционной хроматографии.

4. Внесение биопробы. Небольшие объемы вносят при помощи шприца. Если объем биопробы составляет несколько литров, то рас­твор подается на колонку с помощью насоса.

5. Разделение. Проводят градиентное элюирование, причем формируют подвижную фазу с градиентом ионной силы (с помощью градиентного сме­сителя). При этом суммарный объем элюента должен быть равен при­ мерно пяти объемам колонки.

Известно несколько областей применения ионообменной хроматогра­фии в зависимости от вида ионитов.

1. При помощи синтетических ионитов решаются следующие пре­паративные задачи:

• деионизация воды (деминерализованную воду часто ошибочно называют дистиллированной);

• удаление ионогенных примесей, присутствующих в органиче­ских растворителях;

• очистка биополимеров, например, отделение детергентов и амфолитов, присутствующих в растворах белковых препаратов;

• получение препаратов радиоактивных изотопов;

• ускорение процессов за счет использования в качестве катализаторов многих технологических процессов — омыления, дегидратации, гидратации, полимеризации, перегруппировки, образования ацетатов, нитрования, эпоксидирования и др.

Возможно решение ряда важных аналитических задач, таких как:

• определение общего содержания солей в растворе (путем ионообмена и последующего определения концентрации ионов водорода);

• удаление посторонних ионов при неорганическом анализе (на­пример, железа, алюминия, никеля, фтора и др.);

• анализ гидролизатов белков, олигонуклеотидов, полисахаридов;

• определение уровня загрязнения окружающей среды;

2. При помощи ионитов на основе сефадекса и целлюлозы решают­ся следующие задачи:

• препаративное выделение белков, пептидов, олигонуклеотидов;

• выделение полисахаридов и липидов, несущих заряженные группы;

• иммобилизации ферментов.

3. Иониты на основе агарозы применяются в тех же целях, что и сефадексы; кроме того, на них можно фракционировать вещества с молекулярной массой до 10^-6 г/моль.

4. Модифицированные силикагели используются в режиме высокого давления для разделения всех классов заряженных веществ в аналити­ческом и препаративном масштабе.